辛伐他汀對(duì)骨折血腫細(xì)胞增殖和成骨分化的影響.pdf

1、目的:1.分離、培養(yǎng)和鑒定入骨折血腫細(xì)胞(human fracture haematoma cells,hFHCs);
　　 2.評(píng)價(jià)不同濃度辛伐他汀(Simvastatin)對(duì)體外培養(yǎng)骨折血腫細(xì)胞增殖和成骨分化潛能的影響;
　　 3.探討辛伐他汀通過影響骨折血腫細(xì)胞增殖和成骨分化進(jìn)而影響骨折愈合的可能機(jī)制。
　　 方法:1.取材:暴露骨折斷端,取機(jī)化血腫,組織塊移行生長(zhǎng)法分離出骨折血腫細(xì)胞;
　　 2.

2、骨折血腫細(xì)胞離體培養(yǎng):在α-MEM普通培養(yǎng)基(含10％熱滅活胎牛血清(fetal bovine scrum,FBS)、2mmol/L L-谷氨酰胺、青霉素G100U/ml、鏈霉素100μg/ml)中,37℃、5%CO2條件下培養(yǎng),待細(xì)胞生長(zhǎng)至匯合時(shí),0.25%胰蛋白酶(含0.02%EDTA)消化,傳代;
　　 3.骨折血腫細(xì)胞鑒定:(1)形態(tài)觀察:倒置相差顯微鏡下觀察骨折血腫細(xì)胞活體細(xì)胞形態(tài)變化。(2)流式細(xì)胞儀(flow cy

3、tometer,FCM)檢測(cè)骨折血腫細(xì)胞表面標(biāo)志:測(cè)定整合素家族成員CD29(間充質(zhì)干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志)、CD14、CD34、泛白細(xì)胞標(biāo)志抗原CD45和CD133(造血干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志);
　　 4.實(shí)驗(yàn)分組:根據(jù)辛伐他汀藥物濃度進(jìn)行分組,對(duì)照組:A組(0mol/L);加藥組:B組(1.0×10-9mol/L)、C組(1.0×10-8mol/L)、D組(1.0×10-7mol/L)、E組(1.0×10-6mol/L);
　　

4、5.骨折血腫細(xì)胞成骨誘導(dǎo):以第三代骨折血腫細(xì)胞為研究對(duì)象,改用成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基(在α-MEM普通培養(yǎng)基中加入10nmol/L地塞米松、10mmol/L甘油磷酸酯、50μg/ml抗壞血酸(Sigma)),各組應(yīng)用相同的成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基,但其含辛伐他汀藥物濃度成梯度變化,分別處理骨折血腫細(xì)胞;
　　 6.成骨誘導(dǎo)過程中,四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT)比較各組骨折血腫細(xì)胞的增殖能力;
　　 7.成骨誘導(dǎo)過程中,比較各組細(xì)胞的堿性磷

5、酸酶(Alkaline phosphatase.ALP)活性。通過檢測(cè)骨折血腫細(xì)胞的ALP活性反映不同濃度辛伐他汀對(duì)骨折血腫細(xì)胞成骨分化潛能的作用;
　　 8.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(-x±s)表示,采用PASW Statistics18.0統(tǒng)計(jì)軟件包對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。各組間比較采用單因素方差分析(One-WayANONA)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果:1.倒置相差顯微鏡觀察骨折血腫細(xì)胞

6、形態(tài):細(xì)胞從組織塊爬出后,細(xì)胞呈梭形纖維樣細(xì)胞形態(tài),8天左右可達(dá)90%融合,呈集落生長(zhǎng)。傳代細(xì)胞接種2～4小時(shí)迅速貼壁,伸展,重新恢復(fù)梭形等,24小時(shí)基本完成貼壁,細(xì)胞呈均勻生長(zhǎng),不再呈集落生長(zhǎng),細(xì)胞形態(tài)更加單一,排列規(guī)則,5～7天鋪滿瓶底,繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞疊加形成復(fù)層生長(zhǎng),無明顯接觸抑制。第3代細(xì)胞大小較均勻,呈梭形纖維樣細(xì)胞形態(tài),5～6天細(xì)胞達(dá)80%～90%融合,呈有序的漩渦狀結(jié)構(gòu);
　　 2.FCM檢測(cè)骨折血腫細(xì)胞表面標(biāo)志:整

7、合素家族成員CD29表達(dá)率為84.74%,CD14表達(dá)率為7%,CD34表達(dá)率為3%,CD45表達(dá)率為8%和CD133表達(dá)率為0;
　　 3.MTT法檢測(cè)骨折血腫細(xì)胞增殖:實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:各加藥組OD值與A組(對(duì)照組)比較,均有所增加,說明辛伐他汀對(duì)骨折血腫細(xì)胞增殖有促進(jìn)作用。除B組和A組,C組和E組差異無顯著性(P＞0.05)外,其余各組差異均有顯著性(P＜0.05)。D組對(duì)骨折血腫細(xì)胞增殖促進(jìn)作用最大,當(dāng)辛伐他汀濃度超過1.0

8、×10-7mol/L時(shí),其刺激作用不再隨濃度升高而增強(qiáng);
　　 4.骨折血腫細(xì)胞的ALP活性測(cè)定:實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:各加藥組OD值與A組(對(duì)照組)比較,均有所增加,說明辛伐他汀對(duì)骨折血腫細(xì)胞ALP活性有促進(jìn)作用。除B組和A組,C組和E組差異無顯著性(P＞0.05)外,其余各組差異均有顯著性(P＜0.05)。D組對(duì)骨折血腫細(xì)胞增殖促進(jìn)作用最大,當(dāng)辛伐他汀濃度超過1.0×10-7mol/L時(shí),其刺激作用不再隨濃度升高而增強(qiáng)。