辛伐他汀對骨折血腫細胞增殖和成骨分化的影響.pdf

1、目的:1.分離、培養(yǎng)和鑒定入骨折血腫細胞(human fracture haematoma cells,hFHCs);
　　 2.評價不同濃度辛伐他汀(Simvastatin)對體外培養(yǎng)骨折血腫細胞增殖和成骨分化潛能的影響;
　　 3.探討辛伐他汀通過影響骨折血腫細胞增殖和成骨分化進而影響骨折愈合的可能機制。
　　 方法:1.取材:暴露骨折斷端,取機化血腫,組織塊移行生長法分離出骨折血腫細胞;
　　 2.

2、骨折血腫細胞離體培養(yǎng):在α-MEM普通培養(yǎng)基(含10％熱滅活胎牛血清(fetal bovine scrum,FBS)、2mmol/L L-谷氨酰胺、青霉素G100U/ml、鏈霉素100μg/ml)中,37℃、5%CO2條件下培養(yǎng),待細胞生長至匯合時,0.25%胰蛋白酶(含0.02%EDTA)消化,傳代;
　　 3.骨折血腫細胞鑒定:(1)形態(tài)觀察:倒置相差顯微鏡下觀察骨折血腫細胞活體細胞形態(tài)變化。(2)流式細胞儀(flow cy

3、tometer,FCM)檢測骨折血腫細胞表面標志:測定整合素家族成員CD29(間充質干細胞相關標志)、CD14、CD34、泛白細胞標志抗原CD45和CD133(造血干細胞相關標志);
　　 4.實驗分組:根據辛伐他汀藥物濃度進行分組,對照組:A組(0mol/L);加藥組:B組(1.0×10-9mol/L)、C組(1.0×10-8mol/L)、D組(1.0×10-7mol/L)、E組(1.0×10-6mol/L);
　　

4、5.骨折血腫細胞成骨誘導:以第三代骨折血腫細胞為研究對象,改用成骨誘導培養(yǎng)基(在α-MEM普通培養(yǎng)基中加入10nmol/L地塞米松、10mmol/L甘油磷酸酯、50μg/ml抗壞血酸(Sigma)),各組應用相同的成骨誘導培養(yǎng)基,但其含辛伐他汀藥物濃度成梯度變化,分別處理骨折血腫細胞;
　　 6.成骨誘導過程中,四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT)比較各組骨折血腫細胞的增殖能力;
　　 7.成骨誘導過程中,比較各組細胞的堿性磷

5、酸酶(Alkaline phosphatase.ALP)活性。通過檢測骨折血腫細胞的ALP活性反映不同濃度辛伐他汀對骨折血腫細胞成骨分化潛能的作用;
　　 8.統(tǒng)計學方法:實驗數據以均數±標準差(-x±s)表示,采用PASW Statistics18.0統(tǒng)計軟件包對實驗數據進行分析。各組間比較采用單因素方差分析(One-WayANONA)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。
　　 結果:1.倒置相差顯微鏡觀察骨折血腫細胞

6、形態(tài):細胞從組織塊爬出后,細胞呈梭形纖維樣細胞形態(tài),8天左右可達90%融合,呈集落生長。傳代細胞接種2～4小時迅速貼壁,伸展,重新恢復梭形等,24小時基本完成貼壁,細胞呈均勻生長,不再呈集落生長,細胞形態(tài)更加單一,排列規(guī)則,5～7天鋪滿瓶底,繼續(xù)培養(yǎng)細胞疊加形成復層生長,無明顯接觸抑制。第3代細胞大小較均勻,呈梭形纖維樣細胞形態(tài),5～6天細胞達80%～90%融合,呈有序的漩渦狀結構;
　　 2.FCM檢測骨折血腫細胞表面標志:整

7、合素家族成員CD29表達率為84.74%,CD14表達率為7%,CD34表達率為3%,CD45表達率為8%和CD133表達率為0;
　　 3.MTT法檢測骨折血腫細胞增殖:實驗結果顯示:各加藥組OD值與A組(對照組)比較,均有所增加,說明辛伐他汀對骨折血腫細胞增殖有促進作用。除B組和A組,C組和E組差異無顯著性(P＞0.05)外,其余各組差異均有顯著性(P＜0.05)。D組對骨折血腫細胞增殖促進作用最大,當辛伐他汀濃度超過1.0

8、×10-7mol/L時,其刺激作用不再隨濃度升高而增強;
　　 4.骨折血腫細胞的ALP活性測定:實驗結果顯示:各加藥組OD值與A組(對照組)比較,均有所增加,說明辛伐他汀對骨折血腫細胞ALP活性有促進作用。除B組和A組,C組和E組差異無顯著性(P＞0.05)外,其余各組差異均有顯著性(P＜0.05)。D組對骨折血腫細胞增殖促進作用最大,當辛伐他汀濃度超過1.0×10-7mol/L時,其刺激作用不再隨濃度升高而增強。