MAPK信號通路在高糖導致人腹膜間皮細胞PARP-1激活、細胞外基質(zhì)聚集及轉分化的作用.pdf

1、隨著終末期腎病患病人數(shù)的增加，腎臟替代治療成為腎?？漆t(yī)務人員的關注焦點之一。腹膜透析作為腎臟替代治療的一種，具有以下優(yōu)點：不需要血管通路、不影響日常工作和學習、能較好的清除中分子物質(zhì)、能延緩殘余腎功能下降的速度等。然而，長期使用含葡萄糖的透析液會導致腹膜纖維化，最終放棄腹膜透析。作為長期腹膜透析患者的常見并發(fā)癥，腹膜纖維化不僅損害腹膜結構，也可導致許多并發(fā)癥，是當前研究熱點之一。然而，目前腹膜纖維化的發(fā)生的具體機制仍不清楚，而且防治的措

2、施也較為限，因此，探討其發(fā)病機制及其相關因素，具有重要的意義。
　　 正常情況下，腹膜是一連續(xù)的半透膜，由三層結構構成：一層由扁平狀問皮細胞呈連續(xù)排列所構成的一道單層結構；另一層為問皮細胞(mesothelial cellMCs)下結締組織；兩者之間又有一層基底膜將兩層分隔。腹膜纖維化發(fā)生時，首先受累的是腹膜間皮細胞，表現(xiàn)為細胞間隙擴大，微絨毛減少或消失，細胞膜葡萄糖載體增多；成纖維細胞數(shù)量增加出現(xiàn)問皮細胞層下纖維化。其次是血管

3、的變化，表現(xiàn)為毛細血管數(shù)量增多，且血管基膜增厚。長期腹膜透析的患者，間皮細胞的微絨毛減少、消失，從基底膜脫落至完全消失，最后只剩下裸露的纖維結締組織。
　　 研究發(fā)現(xiàn)，高糖腹膜透析液可導致腹膜間皮細胞肥大。近期研究還發(fā)現(xiàn)間皮細胞的肥大是細胞早期衰老的表現(xiàn)，這可能與腹膜的損傷有關。最終使腹膜對感染和纖維化的防御功能受損，導致纖維化和功能進行性喪失。
　　 研究顯示：高糖引起活性氧化產(chǎn)物(reactive oxygen sp

4、ecies，ROS)可能在腹膜纖維化中起重要的作用。我們既往的研究表明，在人腹膜間皮細胞(humanperitoneal mesothelial cells,HPMCs)高血糖介導的ROS可以使多聚ADP核糖聚合酶[poly(ADP-ribose)polymerase，PARP]活性增加。研究顯示，高糖誘導腹膜間皮細胞PARP-1表達增加；下調(diào)PARP-1的表達能部分逆轉高糖誘導的腹膜問皮細胞轉分化及細胞外基質(zhì)積聚。而絲裂素原活化蛋白激

5、酶通路可被活性氧化產(chǎn)物而激活。ROS可激活MAPK，又可活化PARP-1。研究表明，PARP-1的活化可以通過細胞DNA損傷或非DNA損傷而介導，并呈細胞損傷程度和時間依賴性。在細胞損傷早期，通過細胞信號傳導，PARP-1表達上調(diào)；后期，大量ROS損傷DNA，活化PARP-1，進而調(diào)節(jié)細胞修復損傷、炎癥反應、細胞凋亡等。活化PARP-1的依賴DNA損傷與非依賴DNA兩種平行方式時有重疊，這對在細胞生理、病理狀態(tài)下PARP-1的功能調(diào)節(jié)有

6、重要意義。有研究認為，在細胞受損早期，細胞外信號可通過MAPK信號通路激活PARP-1，參與免疫應答、炎癥反應；大量ROS可通過MAPK通路介導PARP-1活化，參與細胞凋亡等。
　　 目前，在高糖刺激下，MAPK信號通路是否參與HPMCs的PARP-1的激活，目前尚不清楚。本研究就以上問題試圖初步探討MAPK信號通路和PARP-1的關系及其激活在腹膜間皮細胞轉分化及腹膜纖維化當中的作用。這將為腹膜纖維化的防治開拓新的視野和途徑

7、，同時為新藥的開發(fā)和研制奠定基礎。
　　 第一章高糖對HPMCs的MAPK通路及PARP-1的影響
　　 一、目的
　　 探討人腹膜間皮細胞株HMrSV5在高糖刺激下，三條主要MAPK信號通路的活化情況及PARP-1的蛋白表達情況。
　　 二、材料和方法
　　 無血清培養(yǎng)HMrSV5細胞株16h～24h后，分別用高糖(終濃度138mmol/L葡萄糖)刺激0'、5'、30'、1h、2h、8h、24h

8、，并選擇等滲的甘露醇作為對照用。Western Blot分別檢測不同時間總的P38MAPK及磷酸化的P38MAPK、總的ERK1/2及磷酸化的ERK1/2、總的JNK及磷酸化的JNK的蛋白表達水平。同時用Western blot檢測在不同時間點PARP-1的蛋白表達情況。
　　 三、小結
　　 高糖以時間依賴的方式刺激HPMCs后，磷酸化的P38MAPK及磷酸化的JNK表達增加，磷酸化的ERK1/2增高不明顯。同時PAR

9、P-1的表達在高糖刺激下也呈時間依賴性增高，24小時已很明顯。因此我們選擇P38MAPK信號通路的特異抑制劑及JNK信號通路特異抑制劑分別抑制P38MAPK及JNKMAPK，觀察抑制其通路后，PARP-1的活性變化及對腹膜間皮細胞外基質(zhì)聚集及對HPMCs轉分化的作用。
　　 第二章 MAPK抑制劑對PARP-1、腹膜間皮細胞外基質(zhì)聚集及細胞轉分化的作用
　　 第一節(jié) P38抑制劑對PARP-1的作用、人腹膜間皮細胞外基質(zhì)

10、聚集及細胞轉分化的作用
　　 一、目的
　　 探討 P38抑制劑對腹膜間皮細胞外基質(zhì)聚集及細胞轉分化的作用；抑制P38MAPK信號通路后，PARP-1的活性變化。
　　 二、材料和方法
　　 無血清培養(yǎng)HPMCs16h-24h后，分為4各組：①低糖組(5.6mmol/L葡萄糖)；②刺激組(138mmol/L葡萄糖)；③抑制劑組(138mmol/L葡萄糖+SB203580，10umol/L)④DMSO對照組

11、。在24小時收取細胞用Western blot檢測PARP-1、FN、PAI-1、E-cadherin及α-SMA的蛋白水平變化。
　　 三、小結
　　 高糖可刺激腹膜間皮細胞外基質(zhì)聚集及人腹間皮細胞轉分化，P38抑制劑可逆轉。P38抑制劑也可下調(diào)其PARP-1的表達，提示P38MAPK可能能激活PARP-1的表達，并參與腹膜間皮細胞外基質(zhì)聚集及人腹間皮細胞轉分化的過程。
　　 第二節(jié) JNK抑制劑對PARP-1

12、的、人腹膜間皮細胞外基質(zhì)聚集及細胞轉分化的作用
　　 一、目的
　　 探討 JNK抑制劑對腹膜間皮細胞外基質(zhì)聚集及細胞轉分化的作用；抑制JNK信號通路后，PARP-1的活性變化。
　　 二、材料和方法
　　 無血清培養(yǎng)人腹膜間皮細胞株16h-24h后，分為4各組：①低糖組(5.6mmol/L葡萄糖)；②刺激組(138mmol/L葡萄糖)；③抑制劑組(138mmol/L葡萄糖+SP600125，10umol

13、/L)④DMSO對照組。在24小時收取細胞用Westem blot檢測PARP-1、FN、PAI-1、E-cadherin及α-SMA的蛋白水平變化。
　　 三、小結
　　 高糖可刺激腹膜間皮細胞外基質(zhì)聚集及人腹間皮細胞轉分化，JNK抑制劑可逆轉，這提示JNK-PARP-1通路也參與腹膜間皮細胞外基質(zhì)聚集及人腹間皮細胞轉分化的過程。
　　 全文總結:高糖可使得人腹膜間皮細胞P38MAPK及JNKMAPK通路的活化