microRNA-15b在腹膜間皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化中的作用與機(jī)制研究.pdf

1、目前終末期腎臟病(end-stage renal disease，ESRD)的一體化治療中，血液透析和腹膜透析是兩種重要的治療方式。相對(duì)于血液透析而言，腹膜透析具有保護(hù)殘余腎功能、提供持續(xù)超濾、利于患者血壓控制與液體平衡、中分子物質(zhì)清除效果好、患者得以回歸社會(huì)等優(yōu)點(diǎn)。在腹膜透析過程中，各種急慢性原因所導(dǎo)致的腹膜病變可引起腹膜纖維化，并最終導(dǎo)致腹膜超濾失敗，這是患者退出腹膜透析的重要原因之一。其中，腹膜間皮細(xì)胞的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化（epi

2、thelial-to-mesenchymal transition，EMT）在腹膜透析(peritoneal dialysis，PD)相關(guān)性腹膜纖維化中起關(guān)鍵作用，其主要表現(xiàn)為上皮細(xì)胞標(biāo)志物如E-cadherin、ZO-1等表達(dá)降低，而間充質(zhì)標(biāo)志物如Vimentin、α-SMA等表達(dá)升高。研究顯示，miRNAs參與了多種細(xì)胞的EMT過程，進(jìn)而調(diào)節(jié)器官或組織的纖維化，但其在腹膜間皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化中的扮演的角色及其可能的機(jī)制尚未完全明確，仍有待

3、進(jìn)一步研究。因此，是否能通過調(diào)節(jié)miRNAs的表達(dá)，進(jìn)而抑制腹膜間皮細(xì)胞EMT的發(fā)生是腹膜纖維化預(yù)防和治療的新方向。
　　目的：探討microRNA-15b對(duì)人腹膜間皮細(xì)胞向上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化(EMT)的調(diào)節(jié)作用及可能的分子機(jī)制。
　　方法：1.進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，用不同濃度的高糖溶液刺激人腹膜間皮細(xì)胞株(HMrSV5)，篩選最佳的高糖刺激濃度及時(shí)間點(diǎn)。2.使用138mmol/L高糖溶液刺激HMrSV5細(xì)胞24h，觀察高糖溶液對(duì)HMr

4、SV5細(xì)胞microRNA-15b表達(dá)的影響。3.轉(zhuǎn)染microRNA-15b模擬物（microRNA-15b mimic）使HMrSV5中microRNA-15b過表達(dá)或轉(zhuǎn)染microRNA-15b抑制劑(microRNA-15b inhibitor)抑制HMrSV5中microRNA-15b的表達(dá)，再給予138mmol/L高糖溶液刺激24小時(shí)，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR、western印跡等方法，觀察過表達(dá)microRNA-15b或抑制

5、表達(dá)microRNA-15b對(duì)高糖誘導(dǎo)的HMrSV5細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白和基因表達(dá)的影響。4.觀察調(diào)節(jié)microRNA-15b后，Smad通路蛋白的mRNA和蛋白表達(dá)的改變。
　　結(jié)果：1.根據(jù)細(xì)胞生物活性及蛋白表達(dá)情況選擇最佳刺激為138mmol/L高糖溶液，最佳時(shí)間為24h。2.138mmol/L高糖溶液的刺激，可使HMrSV5中microRNA-15b表達(dá)明顯升高(P＜0.05)。3.轉(zhuǎn)染microRNA-15b模擬物后高糖誘

6、導(dǎo)下的上皮標(biāo)志物E-cadherin蛋白的表達(dá)明顯降低，并且高糖引起的間充質(zhì)標(biāo)志物Vimentin及纖維化標(biāo)記Fibronectin(FN)mRNA和蛋白表達(dá)增加(P＜0.05);而轉(zhuǎn)染microRNA-15b抑制劑則結(jié)果相反。4.轉(zhuǎn)染microRNA-15b mimic可明顯抑制高糖誘導(dǎo)下腹膜間皮細(xì)胞的Smad7mRNA及蛋白水平的表達(dá)(P＜0.05)，而轉(zhuǎn)染microRNA-15b inhibitor可明顯增強(qiáng)高糖誘導(dǎo)下腹膜間皮細(xì)胞