PARP-1(多聚ADP核糖聚合酶-1)在腹膜間皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化和細(xì)胞外基質(zhì)積聚中的作用.pdf

1、目的：探討PARP-1(多聚ADP核糖聚合酶-1)在高糖誘導(dǎo)的腹膜間皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化和細(xì)胞外基質(zhì)積聚中的作用；觀察腹膜間皮細(xì)胞在高糖誘導(dǎo)下PARP-1(多聚ADP核糖聚合酶-1)的表達(dá)情況，以及高糖對腹膜間皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化和細(xì)胞外基質(zhì)積聚的影響；觀察PARP-1抑制劑PJ34及PARP—lsiRNA對高糖誘導(dǎo)的腹膜間皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化和細(xì)胞外基質(zhì)積聚的干預(yù)作用。 方法：采用胰酶消化法分離SD雄性大鼠原代腹膜間皮細(xì)胞，體外培養(yǎng)至第二代，并常規(guī)鑒

2、定(或人腹膜間皮細(xì)胞株HMrSv5體外培養(yǎng)，常規(guī)傳代)。將細(xì)胞靜止24小時使其同步化后，加入不同濃度葡萄糖(1.36％、2.27％、3.86％)孵育，并檢測不同時間點(0h、12h、24h、48h、72h)大鼠腹膜間皮細(xì)胞PARP-1表達(dá)的變化；另外用葡萄糖(2.27％)刺激腹膜間皮細(xì)胞24小時，觀察PARP-1、α—SMA、E—cadherin、PAI-1、FN、Col-1、vimentin表達(dá)的變化，部分實驗組中應(yīng)用PARP-1抑制

3、劑PJ34(3×10-6M)或PARP-1 siRNA(5×10-8M)進(jìn)行干預(yù)處理，分別收集總RNA和蛋白以備檢測。 結(jié)果：⑴培養(yǎng)的RPMCs呈多邊形，菱形，橢圓形，大小不等。細(xì)胞融合后，呈典型的鵝卵石狀或鋪路石樣上皮細(xì)胞形態(tài)。免疫組化結(jié)果示細(xì)胞角蛋白陽性。⑵RT—PCR結(jié)果顯示，正常RPMCs經(jīng)高糖(1.36％)刺激以后，PARP-1 mRNA的表達(dá)增加，24小時達(dá)到高峰。高糖刺激RPMCs后可誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)PARP-1 mRN

4、A的表達(dá)上升，以2.27％葡萄糖為顯著；2.27％葡萄糖組是對照組的2.20倍(P<0.05)。PJ34處理后可以顯著降低其表達(dá)，較2.27％葡萄糖組下降了45.0％(p<0.05)。Western blot結(jié)果顯示，2.27％葡萄糖可誘導(dǎo)PARP-1蛋白表達(dá)上調(diào)，是對照組的1.97倍(p=0.05)。PJ34可明顯逆轉(zhuǎn)這種表達(dá)上調(diào)，使其蛋白表達(dá)下降，相比2.27％葡萄糖組下降了51.1％(p<0.05)。⑶2.27％葡萄糖誘導(dǎo)腹膜間皮

5、細(xì)胞轉(zhuǎn)分化標(biāo)志α—SMA表達(dá)上調(diào)，其mRNA水平為對照組的2.06倍(p<0.05)。PJ34處理后可以阻斷由2.27％葡萄糖誘導(dǎo)的α—SMA表達(dá)上調(diào)，使α—SMA mRNA降低，相比2.27％葡萄糖組下降了33.8％(p<0.05)。Western blot結(jié)果也顯示，2.27％葡萄糖可誘導(dǎo)α—SMA蛋白表達(dá)上調(diào)，是對照組的2.37倍(p=0.05)。PJ34可明顯逆轉(zhuǎn)這種表達(dá)上調(diào)，使其蛋白表達(dá)下降，相比2.27％葡萄糖組下降了62.

6、6％(p<0.05)。RT—PCR結(jié)果顯示，2.27％葡萄糖可誘導(dǎo)E—Cadherin mRNA的表達(dá)下調(diào)，下降至對照組的27.6％(p<0.05)。PJ34可以明顯逆轉(zhuǎn)這種表達(dá)的下調(diào)，使其表達(dá)比2.27％葡萄糖組上升了40.0％(p<0.05)。Western blot結(jié)果也顯示，2.27％葡萄糖可誘導(dǎo)E—Cadherin蛋白表達(dá)下調(diào)，下降至對照組的25.2％(p<0.05)。PJ34可明顯逆轉(zhuǎn)這種表達(dá)下調(diào)，使其蛋白表達(dá)上調(diào)，相比2.

7、27％葡萄糖組上升了137％(p<0.05)。⑷2.27％葡萄糖可誘導(dǎo)RPMCs PAI-1的mRNA表達(dá)上調(diào)，為對照組的1.85倍(p<0.05)。PJ34可顯著降低PAI-1的mRNA表達(dá)水平，使其降低了42.2％(p<0.05)。Western blot結(jié)果顯示，2.27％葡萄糖可誘導(dǎo)PAI-1蛋白表達(dá)上調(diào)，是對照組的2.48倍(p<0.05)。PJ34可明顯逆轉(zhuǎn)這種表達(dá)上調(diào)，使其蛋白表達(dá)下降，相比2.27％葡萄糖組下降了69.7

8、％(p<0.05)。RT—PCR結(jié)果顯示，2.27％葡萄糖可誘導(dǎo)FN mRNA的表達(dá)上調(diào)，是對照組的1.32倍(p<0.05)。PJ34可以明顯逆轉(zhuǎn)這種表達(dá)的上調(diào)，使其表達(dá)比2.27％葡萄糖組下降了30.7％(p<0.05)。Western blot結(jié)果顯示，2.27％葡萄糖可誘導(dǎo)Col-1蛋白表達(dá)上調(diào)，是對照組的2.06倍(p<0.05)。PJ34可明顯逆轉(zhuǎn)這種表達(dá)上調(diào)，使其蛋白表達(dá)下降，相比2.27％葡萄糖組下降了75.7％(p<0

9、.05)。⑸2.27％葡萄糖能顯著上調(diào)HPMCs對PARP-1、α—SMA、PAI-1的表達(dá)，與對照組比較，mRNA表達(dá)分別上調(diào)1.67、4.21及2.32倍，蛋白表達(dá)分別上調(diào)1.46、1.57及2.19倍(p<0.05)。加PARP—lsiRNA后，上述PARP-1、α—SMA、PAI-1的高表達(dá)被顯著抑制，與2.27％葡萄糖組比較，mRNA表達(dá)的抑制率分別為34.3％、52.8％及62.1％，蛋白質(zhì)表達(dá)的抑制率分別為33.3％、30

10、.6％、68.3％(p<0.05)。高糖(2.27％)顯著下調(diào)E—cadherin的表達(dá)，與對照組比較，mRNA和蛋白表達(dá)分別下調(diào)78.2％、25.7％(p<0.05)，PARP—lsiRNA能部分逆轉(zhuǎn)這種表達(dá)的下調(diào)，與2.27％葡萄糖組比較，mRNA和蛋白表達(dá)分別上升81.0％、37.0％(p<0.05)。2.27％葡萄糖可誘導(dǎo)FN mRNA的表達(dá)上調(diào)，是對照組的1.61倍(p<0.05)。PARP—lsiRNA可以明顯逆轉(zhuǎn)這種表達(dá)的

11、上調(diào)，使其表達(dá)比2.27％葡萄糖組下降了50.9％(p<0.05)。2.27％葡萄糖可誘導(dǎo)vimentin蛋白表達(dá)上調(diào)，是對照組的2.49倍(p<0.05)。PARP—lsiRNA可明顯逆轉(zhuǎn)這種表達(dá)上調(diào)，使其蛋白表達(dá)下降，相比2.27％葡萄糖組下降了42.3％(p<0.05)。 結(jié)論：①證實腹膜間皮細(xì)胞中存在PARP-1的表達(dá)。②高糖誘導(dǎo)腹膜間皮細(xì)胞PARP-1表達(dá)增加，并能夠誘導(dǎo)腹膜間皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化及細(xì)胞外基質(zhì)積聚。③下調(diào)PAR