PD-L1高表達(dá)的間質(zhì)細(xì)胞通過(guò)誘導(dǎo)免疫耐受促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：前期的實(shí)驗(yàn)研究證明一定量的化療藥物,如順鉑處理腫瘤細(xì)胞之后,腫瘤細(xì)胞上 PD-L1的表達(dá)水平增高,這也是順鉑對(duì)于惡性腫瘤的治療預(yù)后不好的原因之一。順鉑是不是也可以誘導(dǎo)腫瘤微環(huán)境中纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等的PD-L1的表達(dá)量上升導(dǎo)致腫瘤微環(huán)境的免疫耐受,使惡性腫瘤繼續(xù)發(fā)生、發(fā)展?本研究通過(guò)基因工程技術(shù)構(gòu)建表達(dá) mPDLl真核表達(dá)載體,在 L929細(xì)胞中穩(wěn)定高表達(dá),通過(guò)PD-L1轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的構(gòu)建及其功能的研究進(jìn)一步探討PD-L1信號(hào)發(fā)

2、揮作用的分子機(jī)制及其與腫瘤發(fā)生的關(guān)系。
　　方法：(1)不同濃度的化療藥物 DDP處理L929細(xì)胞,流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè) PD-L1在 L929細(xì)胞上表達(dá)水平;(2)PCR方法擴(kuò)增得到小鼠的PD-L1全長(zhǎng)片段,以pcDNA3.1(+)真核表達(dá)質(zhì)粒為載體,構(gòu)建得到重組質(zhì)粒 pcDNA3.1(+)-PD-L1。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到小鼠成纖維細(xì)胞(L929),通過(guò) G418篩選得到高表達(dá)PD-L1的穩(wěn)定細(xì)胞株并經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(

3、Reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)、細(xì)胞免疫熒光、流式細(xì)胞術(shù)鑒定。用絲裂霉素處理過(guò)的PD-L1高表達(dá)細(xì)胞與小鼠脾淋巴細(xì)胞共培養(yǎng),流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) PD-L1對(duì)淋巴細(xì)胞增殖作用的影響。(3)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分組:實(shí)驗(yàn)組(混合接種了B16細(xì)胞和L929-pcDNA3.1(+)-PDL1細(xì)胞的小鼠)、對(duì)照組1(單獨(dú)接種 B16細(xì)胞)、對(duì)照組2(混合接種 B16細(xì)胞和L929-

4、pcDNA3.1(+)細(xì)胞)、對(duì)照組3(混合接種滅活 B16細(xì)胞和L929-pcDNA3.1(+)-PDL1細(xì)胞)。按實(shí)驗(yàn)分組將細(xì)胞混合腋下接種昆明小鼠,在動(dòng)物水平觀察間質(zhì)細(xì)胞中PD-L1表達(dá)水平的改變對(duì)腫瘤生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移的影響并測(cè)定免疫學(xué)指標(biāo)。
　　結(jié)果：(1)分別以2μg/ml、1μg/ml、0.5μg/ml DDP刺激 L929細(xì)胞之后,L929細(xì)胞上的PD-L1的表達(dá)水平增高。但以更低劑量的DDP刺激 L929細(xì)胞之后無(wú)PD-

5、L1表達(dá)水平的改變。(2)PCR方法獲得小鼠PD-L1全長(zhǎng)基因,通過(guò) EcoRI/XhoI雙酶切及測(cè)序證實(shí)構(gòu)建的重組質(zhì)粒 pcDNA3.1(+)-PD-L1正確;轉(zhuǎn)染細(xì)胞經(jīng) G418篩選后獲得穩(wěn)定表達(dá) mPD-L1的L929細(xì)胞株:RT-PCR顯示轉(zhuǎn)染 pcDNA3.1(+)-PDL1質(zhì)粒的L929細(xì)胞出現(xiàn)約900bp條帶(mPD-L1 mRNA的表達(dá)),對(duì)照組無(wú)目的條帶出現(xiàn);熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染 pcDNA3.1(+)-PDL1質(zhì)粒的

6、L929細(xì)胞可見(jiàn)紅色熒光,表明有 PD-L1蛋白的表達(dá),陰性對(duì)照細(xì)胞(轉(zhuǎn)染 pcDNA3.1(+)質(zhì)粒的L929細(xì)胞)未見(jiàn)紅色熒光;流式細(xì)胞術(shù)鑒定轉(zhuǎn)染空載 pcDNA3.1(+)的L929細(xì)胞相比,轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)-PD-L1的細(xì)胞的熒光值明顯增高,確定重組質(zhì)粒在 L929細(xì)胞中高效表達(dá)。(3)PD-L1抑制小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖。(4)小鼠的腫瘤生長(zhǎng)率實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組快;實(shí)驗(yàn)組小鼠血清使雞血紅細(xì)胞溶血率顯著降低,間接反映小鼠機(jī)體

7、免疫能力較對(duì)照組小鼠降低了;實(shí)驗(yàn)組小鼠脾臟 NK細(xì)胞對(duì) B16細(xì)胞的殺傷活性較對(duì)照組降低;實(shí)驗(yàn)組小鼠淋巴細(xì)胞增殖能力較對(duì)照組減弱。
　　結(jié)論：(1)低劑量 DDP刺激 L929細(xì)胞可以上調(diào)其 PD-L1表達(dá)量;(2)成功構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒 pcDNA3.1(+)-PD-L1;(3)建立穩(wěn)定表達(dá) mPD-L1的L929細(xì)胞株L929-pcDNA3.1(+)-PDL1且有生物學(xué)活性;(4)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)間質(zhì)細(xì)胞中PD-L1高表達(dá)形成的免疫