狼瘡性腎炎PD-L1表達(dá)及其基因轉(zhuǎn)染的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、本文對(duì)狼瘡性腎炎PD-L1表達(dá)及其基因轉(zhuǎn)染進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)研究。 方法與結(jié)果： 1.首先以免疫組織化學(xué)和原位雜交染色方法觀察了PD-L1-PD-1信號(hào)通路在Ⅳ型LN患者腎組織中的表達(dá)，并分析PD-L1表達(dá)和PD-1表達(dá)、小管-間質(zhì)病理?yè)p害程度之間的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Ⅳ型LN的腎小管上皮細(xì)胞表達(dá)PD-L1及其mRNA較正常腎組織高，PD-1作為PD-L1的受體，表達(dá)在PD-L1陽(yáng)性的腎小管周?chē)拈g質(zhì)淋巴細(xì)胞上；PD-L1表達(dá)的陽(yáng)性強(qiáng)

2、度和腎皮質(zhì)小管-間質(zhì)PD-1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)成正相關(guān)，和小管-間質(zhì)病理?yè)p害程度呈負(fù)相關(guān)，推測(cè)在Ⅳ型LN中PD-L1-PD-1表達(dá)增強(qiáng)，以抑制淋巴細(xì)胞的過(guò)度激活，維持LN的自身耐受。 2.為進(jìn)一步在體外明確腎小管上皮細(xì)胞表達(dá)PD-L1的影響因素及其與T細(xì)胞的相互作用，以RT-PCR、FACS、免疫細(xì)胞化學(xué)染色方法觀察了人IFN-γ對(duì)體外培養(yǎng)的人近端腎小管上皮細(xì)胞株HK2細(xì)胞表達(dá)PD-L1的影響，以及PD-1在人T淋巴細(xì)胞株Jurkat細(xì)

3、胞上的表達(dá)，并通過(guò)二者共培養(yǎng)，以ELISA方法觀察Jurkat細(xì)胞分泌IL-2的變化，以及抗人PD-L1抗體的阻斷效應(yīng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)正常的HK2細(xì)胞表達(dá)少量PD-L1，IFN-γ可促進(jìn)HK2細(xì)胞表達(dá)PD-L1，并有時(shí)間和劑量的依賴(lài)性。TPA誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞表達(dá)PD-1。在HK2細(xì)胞與Jurkat細(xì)胞共培養(yǎng)之前，先用小鼠抗人PD-L1單克隆抗體與IFN-γ刺激的HK2細(xì)胞共孵育，則共培養(yǎng)上清中IL-2含量較無(wú)抗體阻斷的共培養(yǎng)上清中IL-2

4、含量明顯升高，說(shuō)明PD-L1通過(guò)與PD-1的結(jié)合負(fù)調(diào)節(jié)Jurkat細(xì)胞的活性。增強(qiáng)腎小管上皮細(xì)胞PD-L1的表達(dá)可能有助于改善小管-間質(zhì)的損傷。 3.在完成以上兩部分實(shí)驗(yàn)之后，利用同源重組將PD-L1基因融合到Ⅴ型腺病毒載體基因組中，再通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，將構(gòu)建好的pAdeasy-PD-L1-EGFP重組腺病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，包裝成腺病毒，篩選能產(chǎn)生高滴度重組腺病毒的293細(xì)胞，并對(duì)其進(jìn)行了PCR、Western-blot、活性

5、和安全性等檢測(cè)。結(jié)果表明成功構(gòu)建了腺病毒質(zhì)粒pAdeasy-PD-L1-EGFP；經(jīng)酶切和測(cè)序鑒定，腺病毒重組基因組中不僅有目的基因PD-L1，而且可正常表達(dá)PD-L1，是具有完整功能和感染能力的腺病毒；氯化銫密度梯度離心法純化的pAdeasy-PD-L1-EGFP能抑制小鼠混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)，而腺病毒空載體AdF-EGFP無(wú)此作用，說(shuō)明pAdeasy-PD-L1-EGFP是有活性的；重組腺病毒對(duì)非包裝細(xì)胞Hela細(xì)胞無(wú)毒性，說(shuō)明無(wú)野生型

6、病毒的存在，證明了載體的安全性，且符合病毒轉(zhuǎn)染所需要的滴度，為BXSB狼瘡鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。 4.通過(guò)尾靜脈注射pAdeasy-PD-L1-EGFP和ICOSL抗體治療8周齡BXSB狼瘡鼠，觀察蛋白尿的發(fā)生率、dsDNA抗體產(chǎn)生和IgG在腎組織的沉積以及腎組織的病理變化。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)以pAdeasy-PD-L1-EGFP靜脈注射BXSB狼瘡鼠后，PD-L1可有效轉(zhuǎn)染近端腎小管上皮細(xì)胞，與PBS組和AdF組比較，pAdeasy-P

7、D-L1-EGFP治療組狼瘡鼠的蛋白尿和dsDNA抗體產(chǎn)生減少，IgG在腎組織沉積減少，腎組織病理?yè)p傷減輕。較之pAdeasy-PD-L1-EGFP組，pAdeasy-PD-L1-EGFP+ICOSL抗體聯(lián)合治療組，蛋白尿和dsDNA抗體產(chǎn)生明顯減少，IgG在腎組織沉積減少，同時(shí)明顯延緩了腎小球和腎小管-間質(zhì)病理?yè)p傷的出現(xiàn)。 結(jié)論： 1.PD-L1-PD-1信號(hào)通路在Ⅳ型LN患者腎小管-間質(zhì)中有表達(dá)，PD-L1表達(dá)強(qiáng)度與

8、小管-間質(zhì)病理?yè)p害程度呈負(fù)相關(guān)；體外培養(yǎng)的人近端腎小管上皮細(xì)胞株HK2細(xì)胞在IFN-γ誘導(dǎo)下表達(dá)PD-L1增強(qiáng)且負(fù)調(diào)節(jié)T細(xì)胞的活性。近端腎小管上皮細(xì)胞表達(dá)的PD-L1有可能通過(guò)與小管-間質(zhì)中淋巴細(xì)胞上的PD-1結(jié)合，抑制淋巴細(xì)胞的活性而減輕腎組織的損傷； 2.BXSB狼瘡鼠體內(nèi)注射重組腺病毒pAdeasy-PD-L1后，PD-L1可有效轉(zhuǎn)染腎小管上皮細(xì)胞，并減輕狼瘡鼠的病變；pAdeasy-PD-L1和ICOSL抗體聯(lián)合治療，更