Kupffer細(xì)胞表達(dá)PD-L1在大鼠肝移植免疫耐受誘導(dǎo)中的作用.pdf

1、目的：（1）建立穩(wěn)定的大鼠肝移植動(dòng)物模型，觀察從Brown Norway（BN）→BN和Lewis（LEW）→BN大鼠肝移植術(shù)后移植肝臟的免疫反應(yīng)、程序性死亡配體1（programmed death ligand1，PD-L1）以及輔助性T細(xì)胞1類（T helper cells-1，Th1）和輔助性T細(xì)胞2類（T helper cells-2，Th2）細(xì)胞因子在移植肝臟中的表達(dá)情況。（2）分離術(shù)后7天移植肝臟中的枯否細(xì)胞（Kupffer

2、 cells，KCs），觀察其表達(dá)PD-L1的情況以及對(duì)淋巴細(xì)胞（lympholeukocytes，LCs）的增殖、凋亡以及功能的影響。（3）利用基因克隆技術(shù)，通過設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并性引物，以大鼠肝臟cDNA為模板，采用pUC19質(zhì)粒載體，克隆大鼠PD-L1基因。（4）構(gòu)建針對(duì)大鼠PD-L1基因編碼區(qū)的短發(fā)夾型RNA（short hairpin ribonucleic acid，shRNA）表達(dá)質(zhì)粒PD-L1-shRNA，觀察PD-L1-shRN

3、A對(duì)KCs PD-L1基因和蛋白表達(dá)的抑制效果及其對(duì)LCs功能的影響，試圖闡明PD-L1與KCs在大鼠肝移植免疫耐受誘導(dǎo)中的作用及機(jī)制。 方法：（1）采用Kamada“二袖套法”建立BN→BN和LEW→BN肝移植動(dòng)物模型。術(shù)后觀察大鼠存活率和生存質(zhì)量，并于1、3、5及7天分別活殺6只取外周血及肝臟組織標(biāo)本。光鏡觀察肝臟組織形態(tài)學(xué)改變；全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)外周血漿丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanineaminotransferase，A

4、LT）、天冬氨酸轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase，AST）和總膽紅素（total bilirubin，TBIL）；ELISA、real-time PCR和免疫組織化學(xué)分別檢測(cè)Th1類細(xì)胞因子白介素2（interleukin-2，IL-2）、干擾素γ（interferon-γ，IFN-γ）、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和Th2類細(xì)胞因子白介素10（interleu

5、kin-10，IL-10）在血漿和移植肝臟中的表達(dá)情況，免疫組織化學(xué)檢測(cè)PD-L1在兩種動(dòng)物模型移植肝臟中的表達(dá)情況。（2）分離術(shù)后7天移植肝臟中KCs，real-time PCR和Western-blot分別檢測(cè)KCs PD-L1的基因和蛋白的表達(dá)情況。將KCs與LCs共同培養(yǎng)24h，3H標(biāo)記的脫氧核糖核苷（hydrogen3-thymine deoxyriboside，3H-TdR）摻入法和流式細(xì)胞計(jì)數(shù)分別檢測(cè)LCs的增殖和凋亡情況

6、，ELISA檢測(cè)培養(yǎng)上清液中IL-2、IFN-γ、TNF-α和IL-10的含量。（3）利用PCR技術(shù)，以大鼠肝臟組織cDNA為模板擴(kuò)增PD-L1基因片段，PCR產(chǎn)物膠回收后與載體pUC19連接，并轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)菌，隨機(jī)挑取白色菌落通過PCR和測(cè)序鑒定陽性重組載體的正確性。（4）根據(jù)RNA干擾（ribonucleic acid interfere，RNAi）作用原理設(shè)計(jì)針對(duì)大鼠PD-L1的shRNA，利用pRNAT-U6.2質(zhì)粒，構(gòu)

7、建重組干擾質(zhì)粒pPD-L1-A、pPD-L1-B及其陰性對(duì)照質(zhì)粒pPD-L1-C。經(jīng)PCR及測(cè)序鑒定重組成功后，用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染大鼠KC，轉(zhuǎn)染24小時(shí)以后與活化的T細(xì)胞共同培養(yǎng)。Real-time PCR和Western bolt檢測(cè)干擾質(zhì)粒對(duì)KCs PD-L1基因和蛋白表達(dá)的抑制作用，ELISA檢測(cè)上清液中IL-2、INF-γ、TNF-α和IL-10的含量。 結(jié)果：（1）采用改良的Kamada“二袖套法”成功建立穩(wěn)定的大鼠原位肝移

8、植動(dòng)物模型。發(fā)現(xiàn)BN→BN大鼠肝移植后一直未見明顯的急性排斥反應(yīng)表現(xiàn)，可長(zhǎng)期存活。而LEW→BN大鼠肝移植術(shù)后3天開始出現(xiàn)急性排斥反應(yīng)病理表現(xiàn)（Banff標(biāo)準(zhǔn)），術(shù)后第5至7天比較典型，7只受鼠于16天內(nèi)全部死亡。LEW→BN組大鼠術(shù)后血漿ALT、AST和TBIL呈現(xiàn)進(jìn)行性升高，而BN→BN組則逐漸降至正常范圍，兩組差異明顯（P<0.05）。ELISA結(jié)果顯示：BN→BN組術(shù)后7天，血漿中IL-2、INF-γ和TNF-α（分別為210.

9、68±16.82、170.97±14.64和126.4±15.57，pg/ml）的濃度明顯低于LEW→BN（分別為753.50±12.68、509.83±17.91和427.97±13.49，pg/ml）組，而IL-10（371.13±17.63，pg/ml）的濃度則明顯高于LEW→BN組（187.48±12.89，pg/ml）（P<0.05）。Real-time PCR和免疫組織化學(xué)表明上述細(xì)胞因子在兩種動(dòng)物模型移植肝臟中的表達(dá)情況與

10、其血漿中的表達(dá)趨勢(shì)一致。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示：術(shù)后第7天PD-L1呈強(qiáng)陽性表達(dá)并且表達(dá)范圍廣；而在LEW→BN組PD-L1表達(dá)始終較弱，兩組比較有明顯差異（P<0.05）。 （2）免疫耐受組中KCs PD-L1的表達(dá)明顯高于排斥組（P<0.05）。KCs+LCs共培養(yǎng)組LCs的增殖（13258.34±951.26 cpm）明顯低于LCs單獨(dú)培養(yǎng)組（3047.98±101.42 cpm，P<0.05），而其凋亡率（8.83±0.3

11、7％）卻顯著高于后者（1.34±0.16％，P<0.05）。共培養(yǎng)組上清液的IL-2、TNF-α和INF-γ的含量（分別為186.50±12.68、142.83±17.91和129.97±13.49，pg/ml）明顯低于LCs單獨(dú)培養(yǎng)組（分別為481.76±34.53、357.16±19.88和326.4±15.57，pg/ml），但I(xiàn)L-10在共培養(yǎng)組（108.8±12.89 pg/ml）明顯高于LCs單獨(dú)培養(yǎng)組（49.13±17.6

12、3 pg/ml，P<0.05）。 （3）采用PCR方法從大鼠肝臟組織中擴(kuò)增出約873bp的DNA片段，連接到pUC19載體成功構(gòu)建重組質(zhì)粒，其擴(kuò)增的目的片段經(jīng)PCR和測(cè)序驗(yàn)證為PD-L1基因片段，克隆的PD-L1與GenBank中小鼠PD-L1（NM_008798）序列同源性達(dá)到88％，其翻譯蛋白與小鼠PD-L1理論蛋白同源性為85％。 （4）經(jīng)PCR及測(cè)序證實(shí)重組干擾質(zhì)粒pPD-L1-A、pPD-L1-B及其陰性對(duì)照質(zhì)

13、粒pPD-L1-C構(gòu)建成功，并在脂質(zhì)體介導(dǎo)下可以高效轉(zhuǎn)染KCs。轉(zhuǎn)染24小時(shí)后，RNA干擾組PD-L1表達(dá)水平均明顯低于未轉(zhuǎn)染組和RNAi對(duì)照組。其中pPD-L1-B對(duì)KCs PD-L1的表達(dá)有較好的抑制效果。pPD-L1-B組上清液中IL-2、IFN-γ和TNF-α的含量（分別為448.70±37.61、327.33±24.35和301.62±17.72，pg/ml）明顯高于未轉(zhuǎn)染組（分別為179.60±20.47、153.46±10

14、.70和118.90±15.65，pg/ml），而IL-10的表達(dá)則正好相反（分別為40.03±7.81和103.2±17.46，P<0.05）。 結(jié)論：（1）PD-L1在免疫耐受移植肝臟中的表達(dá)明顯高于急性排斥組，PD-L1可能通過調(diào)節(jié)LCs的功能，影響Th1和Th2細(xì)胞因子的平衡從而參與了移植后免疫反應(yīng)過程的調(diào)控。（2）免疫耐受組移植肝臟中KCs PD-L1的表達(dá)水平明顯高于急性排斥組。高表達(dá)PD-L1的KCs可以顯著性抑制

15、LCs的增殖、活化及功能，可能在誘導(dǎo)免疫耐受方面具有重要作用。（3）成功克隆了PD-L1基因，首次構(gòu)建了pUC19-PD-L1克隆質(zhì)粒?？寺』蚪?jīng)測(cè)序證明與小鼠PD-L1具有較好的同源性。（4）利用克隆的PD-L1可以成功構(gòu)建出PD-L1-shRNA干擾質(zhì)粒，其在體外可以有效抑制KCs PD-L1的表達(dá)，消除KCs對(duì)LCs功能的抑制作用，證實(shí)KCs通過高表達(dá)PD-L1可以有效抑制LCs功能。表明PD-L1與KCs在肝移植免疫耐受的誘導(dǎo)和