非小細胞肺癌中PD-L1的表達調(diào)控及其機制研究.pdf

1、背景及目的：
　　肺癌是世界上發(fā)病率最高的實體瘤之一，而其中非小細胞肺癌（NSCLC）又占據(jù)了大部分比例。雖然針對NSCLC的治療方法如傳統(tǒng)手術(shù)、基于鉑類藥物的化療以及放療等都有迅速的發(fā)展，但是進展期及發(fā)生轉(zhuǎn)移的NSCLC患者仍舊預(yù)后不良。因此，著力探索更新更有效的臨床治療策略是一個亟待解決的問題。
　　現(xiàn)今，靶向表皮生長因子受體（EGFR）的治療藥酪氨酸激酶抑制劑（TKI）吉非替尼和厄洛替尼已經(jīng)成為了治療存在EGFR突變N

2、SCLC患者的一線藥物。同時，靶向免疫“檢查點”如PD-1、PD-L1和CTLA-4的治療藥也已經(jīng)被報道能顯著延長腫瘤患者的中位無進展生存期。但是，如何設(shè)計更合理的治療策略以及如何聯(lián)合以上兩種新治療措施以達到更好療效仍舊所知甚少。
　　最近有研究發(fā)現(xiàn)，具有EGFR突變的NSCLC細胞株會比具有其它突變類型的細胞株表達更高水平的PD-L1，但是其潛在的調(diào)節(jié)機制未有報道。
　　本課題著力于尋找不同NSCLC細胞株EGFR突變狀態(tài)

3、和PD-L1表達的相關(guān)性并考察EGFR-TKIs對EGFR-TKI敏感型以及獲得性耐藥型兩種NSCLC細胞株在體內(nèi)及體外模型中的影響，同時探討該作用的相關(guān)機制。因此，該項工作能夠為臨床抗腫瘤免疫治療的完善提供新的策略。
　　方法：
　　1.NSCLC細胞株EGFR突變狀態(tài)和PD-L1表達的相關(guān)性分析
　　提取NSCLC細胞株的總DNA并用PNA-LNA PCR檢測EGFR突變狀態(tài)。流式細胞分析檢測NSCLC細胞株的PD

4、-L1表達水平。在NSCLC細胞株的培養(yǎng)環(huán)境中加入人源性重組EGF并用流式細胞分析和實時定量PCR檢測其PD-L1的表達。
　　2.EGFR-TKIs對EGFR-TKI敏感型和獲得性耐藥型NSCLC細胞株P(guān)D-L1表達的影響
　　體外實驗部分，在NSCLC細胞株培養(yǎng)環(huán)境中加入不同劑量梯度（0、2.5、5、10、100nM）的吉非替尼刺激一定時間（48小時）或者加入同一劑量（100nM）吉非替尼刺激不同時間（0、6、12、24

5、、48小時），通過流式細胞分析和免疫熒光檢測其PD-L1的表達。體內(nèi)實驗部分，裸鼠皮下注射 NSCLC細胞株，待腫瘤長至一定大小給予吉非替尼灌胃治療，之后測量腫瘤的體積和重量以及用流式細胞分析和免疫熒光檢測腫瘤組織中PD-L1的表達水平。
　　3. NSCLC細胞株中EGFR介導(dǎo)的PD-L1表達上調(diào)過程的機制研究
　　體外實驗部分，用Western Blotting檢測不同NSCLC細胞株中NF-κB p65在胞漿和胞核的表

6、達水平。用不同劑量(0、50、100μM)的NF-κB抑制劑PDTC刺激NSCLC細胞株一段時間并用流式細胞分析檢測其PD-L1表達。在NSCLC細胞株培養(yǎng)環(huán)境中用不同劑量（0、2.5、5、10、100nM）吉非替尼刺激一段時間，用Western Blotting分別檢測其胞漿和胞核NF-κB p65的表達水平。體內(nèi)實驗部分，在上述的吉非替尼治療的裸鼠荷瘤模型中，用免疫熒光檢測各組裸鼠腫瘤組織中NF-κB p65的表達水平。
　　

7、結(jié)果：
　　1.NSCLC細胞株中EGFR活化水平和PD-L1表達相關(guān)
　　PNA-LNA PCR發(fā)現(xiàn)NSCLC細胞株P(guān)C-9、HCC827和H1650具有EGFR基因第19號外顯子的突變而H460、H1299和SPC-1A的EGFR基因無突變。流式細胞分析顯示EGFR突變型細胞株的PD-L1比EGFR野生型細胞株的PD-L1表達更高。流式細胞分析和定量PCR顯示外源性rhEGF刺激EGFR野生型細胞株后能有效上調(diào)其PD-L

8、1的表達。
　　2.吉非替尼能夠可逆性降低EGFR突變型NSCLC細胞株P(guān)D-L1的表達，且該作用具有濃度和時間依賴性
　　流式細胞分析和免疫熒光顯示不同濃度的吉非替尼刺激PC-9和HCC827一段時間或者一定濃度吉非替尼刺激PC-9和HCC827不同持續(xù)時間都能降低其PD-L1的表達水平，且降低程度與藥物作用的濃度及時間呈正相關(guān)。同時，流式細胞分析發(fā)現(xiàn)撤去吉非替尼的刺激或者同時加入外源性rhEGF能夠恢復(fù)吉非替尼預(yù)處理的P

9、C-9細胞株P(guān)D-L1的表達水平。
　　3.吉非替尼能夠降低EGFR-TKI獲得性耐藥NSCLC細胞株的PD-L1表達，并且該作用具有濃度和時間依賴性
　　流式細胞分析顯示吉非替尼也能夠有效降低吉非替尼獲得性耐藥PC-9細胞株P(guān)D-L1的表達，并且PD-L1降低程度與吉非替尼作用的濃度和持續(xù)時間呈正相關(guān)。
　　4.在PC-9細胞株異種種植裸鼠模型中，吉非替尼的治療能夠抑制腫瘤的生長并且降低腫瘤組織PD-L1的表達水平<

10、br>　　吉非替尼治療能夠有效減少裸鼠PC-9皮下種植瘤的體積和重量。同時，流式細胞分析和免疫熒光顯示吉非替尼治療組裸鼠腫瘤組織中PD-L1的表達水平比對照組腫瘤組織的表達水平明顯升高。
　　5.NF-κB通路參與EGFR-TKI對PD-L1的調(diào)控過程
　　Western Blotting結(jié)果顯示，相較于EGFR突變型NSCLC細胞株，在EGFR野生型細胞株中NF-κB p65在胞漿的表達水平更高而在胞核的表達水平更低。流式

11、細胞分析發(fā)現(xiàn)NF-κB抑制劑PDTC處理PC-9細胞株其PD-L1的表達水平明顯升高且升高程度依賴于PDTC的劑量。Western Blotting顯示不同濃度的吉非替尼刺激PC-9細胞株嫩能夠升高NF-κB p65胞漿表達并降低NF-κB p65胞核表達且改作用具有濃度依賴性，但吉非替尼對H1299細胞株NF-κB p65的表達無影響。PC-9細胞株裸鼠異種種植模型中，免疫熒光顯示吉非替尼灌胃治療也能夠降低腫瘤組織中NF-κB p65

12、的核表達。
　　結(jié)論：
　　1. PD-L1在EGFR突變型NSCLC細胞株中高表達并且其在EGFR野生型細胞株中的表達受EGFR信號調(diào)控。
　　2. EGFR-TKI能夠有效降低EGFR-TKI敏感型以及EGFR-TKI獲得性耐藥型NSCLC細胞株中PD-L1的表達水平，并且該作用具有藥物濃度及時間依賴性。
　　3. EGFR-TKI治療能抑制腫瘤生長并降低腫瘤組織中PD-L1的表達。
　　4. EGFR