輸入供體凋亡細胞對受體外周血細胞因子的影響.pdf

1、目前，原位肝移植（Orthotopic liver transplantation，OLT）是治療終末期肝病最有效和常規(guī)措施。然而，盡管由于外科技術的標準化、免疫抑制劑的不斷研發(fā)和應用，移植物的長期存活率沒有明顯提高。器官移植術后的排斥反應仍是威脅患者和移植物長期存活的主要原因。免疫抑制劑的應用，不僅使器官移植成為終末期腎、肝、心臟疾病可接受的治療方式，而且顯著減少了急性排斥的發(fā)生率，同時顯著提高了器官移植病人的短期、長期生存率。然而，

2、免疫抑制劑的應用帶來了許多問題。首先，要終身連續(xù)對免疫系統(tǒng)進行非特異性免疫抑制。第二，當前使用的免疫抑制劑中，沒有一種能完全預防急性排斥或者慢性排斥。第三，免疫抑制劑的應用帶來了腫瘤和感染的風險。第四，免疫抑制劑的應用增加了移植病人高血壓的風險以及由此導致的心血管并發(fā)癥。因此，誘導受者對供者器官特異性免疫耐受是解決排斥反應最理想的措施，相對免疫抑制療法，誘導免疫耐受的優(yōu)勢是從根本上避免了排斥反應，又不影響機體的正常抗感染和免疫監(jiān)視功能，

3、同時避免了藥物毒性。而且，耐受的誘導對于最終克服異種移植免疫學障礙也許是最佳途徑，因為異種移植免疫抑制需長期高水平的、非特異性的免疫抑制劑來維持。因此，誘導移植免疫耐受性，控制移植物排斥反應，保護移植器官的功能，這無論在同種移植和異種移植中都是十分重要的課題。 由于移植免疫耐受的機制十分復雜，盡管誘導免疫耐受的方法眾多，但均未能達到完全可靠持久的特異性耐受。細胞凋亡是生物體內(nèi)普遍存在的一種生理和病理現(xiàn)象，是正常器官和組織發(fā)育、清

4、除有害的、過量的和無功能細胞、維持自身穩(wěn)態(tài)的必要環(huán)節(jié)?，F(xiàn)有研究表明：凋亡是機體免疫狀態(tài)保持平衡和穩(wěn)定的重要作用機制，凋亡細胞對免疫系統(tǒng)存在著主動的調(diào)節(jié)作用。凋亡細胞能分泌脂類趨化因子，改變自身胞膜結(jié)構(gòu)表達“eat-me”信號，誘導吞噬細胞對其進行清除；同時凋亡細胞被抗原提呈細胞吞噬后，通過吞噬細胞分泌抑制性免疫因子如TGF-β、PGE2、IL-10等，造成了特殊的抗原識別微環(huán)境，可以促使相關淋巴細胞針對凋亡抗原產(chǎn)生免疫耐受，而不會引起炎

5、性免疫應答。據(jù)此，孫爾維等提出利用供體凋亡細胞輸注受體誘導供體特異性免疫耐受的理論設想。 細胞因子是活化細胞產(chǎn)生的細胞間信號多肽.大多數(shù)細胞因子都有多種來源，多種作用靶位和多種功效.細胞因子網(wǎng)絡是參與免疫識別、應答反應的重要成分，也是決定免疫反應發(fā)生方向的主要因素之一?？乖晕镔|(zhì)進入機體后引起免疫系統(tǒng)發(fā)生的各種反應變化中包括了細胞因子比例水平的改變，由于后者直接參與前者的發(fā)生過程與最后結(jié)果表現(xiàn)，從而探討細胞因子的變現(xiàn)表現(xiàn)對分析以

6、及預測免疫反應發(fā)生和走向有一定的意義。 我們課題組以前的工作證實，一定數(shù)量的供體凋亡脾淋巴細胞預輸注可以誘導大鼠心、肝臟移植模型產(chǎn)生特異性免疫耐受，延長移植存活的時間。且通過對凋亡細胞進行示蹤實驗，發(fā)現(xiàn)凋亡的脾淋巴細胞主要聚集并駐留于肝臟，且對肝臟組織的細胞因子的微環(huán)境產(chǎn)生了影響。但輸入的過程中是否也影響外周的細胞因子微環(huán)境，這對下部進一步探討誘導凋亡的機制有重要的影響。所以本實驗主要在前期的基礎上，對供體凋亡脾淋巴細胞預輸注是

7、否影響外周血微環(huán)境進行研究。 目的: 已知凋亡細胞發(fā)生免疫調(diào)節(jié)作用時也會同時伴有細胞因子等微環(huán)境的變化。且前期工作證明供體凋亡脾淋巴細胞輸注對受體肝臟內(nèi)細胞因子微環(huán)境有影響，本部分對供體凋亡細胞輸注后對外周血免疫微環(huán)境中一系列重要細胞因子的變化進行觀察，以了解供體凋亡脾淋巴細胞輸注對外周血細胞因子的影響。 方法: 供體C57BL小鼠14只，8-10周，雄性；受體Balb/c小鼠6-8周，50只，雄性。具體

8、如下： （1）機械研磨法分離脾臟細胞，易得分離液分離淋巴細胞。 （2）紫外線照射法誘導凋亡，流式細胞儀檢測細胞凋亡率。 （3）采用尾靜脈輸入法，每處理組每時間點5只小鼠，預輸注處理分組：供體脾臟活細胞處理組（Liver cell treatment group，LG），供體脾臟凋亡細胞處理組（Apoptotic cell treatment group，AG）： （4）檢測時間點：輸注后0h、1h、3h、

9、6h、12h； （5）采用體外心臟采血法，收集樣本； （6）Luminex技術液態(tài)芯片法檢測外周血IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12、GM-CSF（粒細胞-巨細胞激落刺激因子）、IFN-γ、TNF（腫瘤壞死因子）； （7）所有實驗數(shù)據(jù)利用SPSS13.0和GraphPad PRISM3.02等軟件進行統(tǒng)計學分析和作圖。 結(jié)論: 本實驗證明凋亡細胞組和活細胞組

10、相比，外周IL-6在1h時有顯著性差異和IL-10在3h、6h和12h時存在顯著性差異，活細胞組高于凋亡細胞組，其他細胞因子都無顯著性差異，而且活細胞輸注后，3h、6h的IL-10濃度明顯高于0h。凋亡細胞輸注后對細胞因子基本無改變，從IL-6和IL-10的結(jié)果我們可以推測：活細胞輸注后，機體產(chǎn)生了急性炎性反應，使IL-6于1h時升高，而3小時后，機體為了避免炎性反應過度而采取了保護措施，增加IL-10的分泌，阻斷了單核、巨噬細胞合成I

11、L-6、TNFα等介質(zhì)，而凋亡細胞對機體外周血無明顯的作用，根據(jù)凋亡細胞是一種死細胞，具有完整的包膜，在組織中的清理主要為吞噬作用，可能相對于異種的活細胞引起的炎性反應作用較弱。凋亡細胞輸入后，對外周血中GM-CFS濃度在3h時明顯升高和活細胞輸入后，6h時對外周血中IFN-γ濃度的影響有顯著性意義，具體機制還需要進一步研究。而根據(jù)以往的研究，凋亡細胞對機體有明確的作用，可以引起免疫耐受的，而且本課題組的前期研究通過對凋亡細胞進行示蹤實