雞精原干細(xì)胞體外培養(yǎng)及不同細(xì)胞因子的影響.pdf

1、精原干細(xì)胞(spermatogonialstemcells，SSCs)是指位于睪丸生精小管基膜上既能自我更新維持自身群體數(shù)量恒定，又能定向分化形成精母細(xì)胞，最終形成精子的一類原始干細(xì)胞。由于其在轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)及治療不育癥等方面有著誘人的前景，已經(jīng)成為干細(xì)胞研究領(lǐng)域的一個熱點(diǎn)。本研究以出殼6d的雞SSCs為實(shí)驗(yàn)材料，研究了不同培養(yǎng)基在有、無飼養(yǎng)層情況下對SSCs外培養(yǎng)的影響。同時(shí)對SSCs在體外培養(yǎng)條件下的生物學(xué)特性進(jìn)行了研究并進(jìn)行了繼代

2、培養(yǎng)。初步探索了不同細(xì)胞因子：鼠白血病抑制因子(Mouseleukemiainhibitoryfactor，mLIF)、人干細(xì)胞生長因子(Humanstemcellfactor，hSCF)、堿性成纖維生長因子bFGF(Fibroblastgrowthfactor-basic，bFGF)的不同濃度組合對精原干細(xì)胞體外增殖和分化的影響。以期能建立適宜雞SSCs體外長期存活的培養(yǎng)體系并為細(xì)胞的發(fā)育和分化提供細(xì)胞模型，為SSCs的建系奠定基礎(chǔ)。

3、研究結(jié)果總結(jié)如下幾點(diǎn)： 1.采用Percoll密度梯度離心法分離雞SSCs，分別在六種培養(yǎng)體系中進(jìn)行培養(yǎng)，觀察其生長特性及克隆形成率，結(jié)果表明：SSCs在無飼養(yǎng)層的培養(yǎng)體系Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ中雖能生長但存活時(shí)間較短且無法形成克隆。在有飼養(yǎng)層的培養(yǎng)體系Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ存活時(shí)間較長并能形成克隆，克隆形成率分別為31％、26％和10％，差異極顯著(P＜0.01)。 2.SSCs分離提純后，在以DMEM為基礎(chǔ)培養(yǎng)液，在添加10％的胎牛血清、2

4、％的雞血清、2mmol/LL-谷氨酰胺、1mmol/L丙酮酸鈉、5.5×10-5mol/Lβ-巰基乙醇、15ng/mLhSCF、10/mLmLIF、15ng/mLbFGF、100U/mL硫酸慶大霉素、以雞胚成纖維細(xì)胞作飼養(yǎng)層的培養(yǎng)體系中培養(yǎng)，SSCs貼壁良好，并聚集增殖，形成典型的鳥巢狀克隆。共傳了3代，AKP染色陽性克隆率分別是31％、20％和18％，差異極顯著(P＜0.01)。對傳到三代的SSCs克隆進(jìn)行AKP活性檢測及SSEA-1

5、免疫組化染色，均表現(xiàn)為陽性，表明在這種培養(yǎng)體系中，培養(yǎng)至第3代的SSCs仍保持干細(xì)胞未分化特性。 3.采用MTT法分別檢測mLIF、bFGF和SCF三種細(xì)胞因子在單獨(dú)添加和聯(lián)合使用時(shí)對體外培養(yǎng)條件下的SSCs增殖的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明；三種細(xì)胞因子在單獨(dú)添加時(shí)，各實(shí)驗(yàn)組增殖效應(yīng)與對照組比較差異顯著(P＜0.05)。三種因子聯(lián)合使用時(shí)，低劑量時(shí)共同促進(jìn)SSCs的增殖，高劑量時(shí)則抑制SSCs的增殖。推斷SCF、bFGF和mLIF的最佳