細胞因子對外周血樹突狀細胞的體外誘導(dǎo)成熟及其功能影響.pdf

1、[目的]選用幾種不同的細胞因子組合，體外培養(yǎng)人外周血單個核細胞，誘導(dǎo)樹突狀細胞(dendriticcells，DCs)產(chǎn)生，并檢測其表面分子的表達及刺激同種異體T淋巴細胞增殖的功能，從而建立誘導(dǎo)樹突狀細胞的最佳實驗方法。并探討細胞因子對DCs體外誘導(dǎo)、成熟及其功能的影響。 [方法]無菌采集健康人外周血，肝素鈉抗凝，采用密度梯度離心的方法獲得單拿核細胞，用含10％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基在24孔板上貼壁培養(yǎng)2小時，棄去末貼

2、壁細胞，即獲得貼壁細胞，在24孔板上用含以下6組不同細胞因子的RPMI1640培養(yǎng)基進行培養(yǎng)①對照組：不加細胞因子②rhGM-CSF/rhIL-4③rhGM-CSF/rhIL-4/PHA④rhGM-CSF/rhIL-13⑤rhGM-CSFrhIL-13/PHA⑥PHA，各種因子加入的劑量分別為(在培養(yǎng)液中的最終濃度)：rhGM-CSF(50ng/ml)、rhIL-4(40ng/ml)、rhIL-13(40ng/ml)、PHA(50μg/

3、ml)，觀察DC的生成及免疫表型的表達情況。6天后，分別在各組中加入LPS、IL-2、TNF-α等促成熟因子誘導(dǎo)DC成熟,加入的劑量分別為：LPS(20ng/ml)、IL-2(5ng/ml)、TNF-α(20ng/ml)鏡下觀察細胞形態(tài)。流式細胞術(shù)檢測培養(yǎng)3，6，9天細胞CD1a、CD83、CD86、CD209表達：MTT法檢測誘導(dǎo)培養(yǎng)的DC體外刺激同種異體T淋巴細胞增殖的活性，比較各成熟因子對DC作用的影響。 [結(jié)果]1、經(jīng)不

4、同的細胞因子誘導(dǎo)培養(yǎng)6天后，倒置顯微鏡下可見多數(shù)細胞呈懸浮生長，細胞胞體較大，細胞表面可見有不規(guī)則突起。2、在IL-4、GM-CSF組合中加入刺激齊劑TNF-α、LPS或IL-2后，DC表面CD1a、CD83、CD86、CD209表達明顯升高，其刺激同種異體T淋巴細胞的能力明顯增強，刺激細胞/反應(yīng)細胞為1∶10時刺激T細胞增殖能力最明顯。在各組中，尤以TNF-α、LPS和IL-2同時加入組誘導(dǎo)培養(yǎng)的DC免疫表型表達率最高，CD1a、CD

5、83、CD86、CD209表達率分別是：50.2％，48.2％，77.4％，64.3％，刺激T細胞增殖能力最明顯。3、IL-4、GM-CSF組合與IL-13、GM-CSF組合組培養(yǎng)誘導(dǎo)的DC在成熟和功能方面未見有明顯的差異。4、在細胞因子的組合方案中加入PHA后，可看到細胞聚集成團明顯，細胞免疫表型的表達率增高，但單獨加入PHA未能誘導(dǎo)出DC。 [結(jié)論]幾種不同的細胞因子組合都能從健康成人外周血單個核細胞體外誘導(dǎo)出DC，但單純I

6、L-4、GM-CSF組合與IL-13、GM-CSF組合組培養(yǎng)誘導(dǎo)的DC多為不成熟的DC，加入刺激劑TNF-α、LPS或IL-2后，特別是TNF-α、LPS和IL-2同時加入組誘導(dǎo)的DC表面CD1a、CD83、CD86、CD209表達增加，在形態(tài)及功能上具有典型成熟DC的特點。 [意義]探討了幾種不同的細胞因子組合培養(yǎng)誘導(dǎo)人PBMC成DC的方法并在各方法間進行了比較，為尋找一種簡單、有效、經(jīng)濟的誘導(dǎo)培養(yǎng)功能性DC的方法提供了新的實