rFliC誘導同種移植免疫耐受的作用及機理研究.pdf

1、研究目的：
　　目前，同種器官移植已在臨床廣泛開展，對治療器官衰竭、血液疾病以及惡性腫瘤發(fā)揮了不可替代的作用。然而發(fā)生于移植術后數(shù)周或數(shù)月的急性排斥反應(AR,Acute rejection)仍是導致治療失敗的主要因素。移植術后常規(guī)使用的免疫抑制性藥物嚴重降低了患者機體的免疫功能，導致了感染、肝腎損傷，影響了移植受者的預后。為解決這一難題，研究者們利用多種細胞和生物因子及制劑，通過不同途徑誘導機體產生特異性的免疫耐受以克服非特異性

2、的免疫抑制劑的嚴重毒副作用。目前移植免疫耐受研究的熱點之一是擴增調節(jié)性T細胞(Regulatory T cell，Treg)或增強其功能。既往研究表明，Treg細胞是參與維持外周耐受的重要細胞，應用Treg細胞誘導免疫耐受具有多種優(yōu)勢，因而有可能被發(fā)展為誘導移植免疫耐受和治療器官移植排斥的重要工具細胞。
　　目前體外擴增的Treg進行細胞治療方案的應用受到很多因素制約，而應用藥物擴增受體機體內的Treg細胞比例或者增強Treg細胞

3、抑制能力的方案具有更好的應用前景。人體內的Treg細胞主要存在于CD4+CD25hi（高表達）細胞亞群中，約占外周血CD4+T細胞的1％～2％。Treg細胞作為在體內外均具有調節(jié)免疫反應功能的重要細胞群，可根據(jù)其表達的細胞表面分子、產生的細胞因子及作用機制分為天然存在的CD4+CD25+Treg細胞(Naturally occurring CD4+CD25+Treg，nTreg)和誘導性CD4+CD25+Treg細胞(Induced C

4、D4+CD25+Treg，iTreg)。大量動物移植模型的研究證實，兩種Treg細胞對于維持移植物良好生存狀態(tài)都具有重要作用，提高Treg細胞比例可以誘導免疫耐受、減輕排斥反應。在實體器官移植中，與等量nTreg相比，體內和體外同種異體抗原特異性誘導產生的iTreg能更好地延長移植物存活期及誘導免疫耐受。
　　Treg細胞的免疫調節(jié)機制主要包括以下幾個方面:對抗原遞呈細胞(Antigen presenting cell，APC)的

5、抑制作用，介導靶細胞溶解、殺傷靶細胞，分泌TGF-β（Transformation growth factor-β，轉化生長因子-β）和IL-10（Interleukin-10，白介素-10）發(fā)揮免疫抑制功能等。Treg細胞抑制CD4+效應T細胞的機制主要通過細胞間直接接觸、分泌細胞因子、與APC結合后改變其代謝途徑或分泌方式等途徑。Treg細胞除高表達CD4和CD25之外，還表達一種特征性標志Foxp3(Forkhead transc

6、ription factors，叉頭樣轉錄因子3)，其對Treg細胞的表型、發(fā)育和功能性維持具有重要作用。研究發(fā)現(xiàn)機體內Treg細胞比例和Foxp3的表達情況可以作為改善受體免疫狀態(tài)及誘導耐受的重要指標。然而關于如何擴增Treg細胞，上調Foxp3表達以及增強Treg細胞抑制性效應的研究目前仍不夠明確，因此仍需尋找能夠有效擴增機體Treg細胞比例或增強其抑制能力的安全制劑。
　　研究發(fā)現(xiàn)，將人CD4+T細胞與基因重組鞭毛蛋白(rF

7、liC)體外共培養(yǎng)后可顯著增強CD4+CD25+Treg細胞的免疫抑制能力并提高Foxp3的表達。并且鞭毛蛋白可以保護機體免受化學、細菌、病毒以及放射性損傷。因此，鞭毛蛋白或可作為一種能夠增強Treg細胞功能，誘導機體產生移植免疫耐受的制劑。鞭毛蛋白是細菌鞭毛的主要成分，是Toll樣受體5(Toll-like receptor 5，TLR5)的特異性配體。TLR5在人T細胞以及小鼠Treg細胞上均有表達。Toll樣受體(TLR)家族是介

8、導天然免疫的重要因素，可在病原體入侵機體的早期即啟動天然免疫，繼而激活獲得性免疫應答，對免疫病理損傷有重要作用。鞭毛蛋白介導的免疫應答依賴于經典的TLR信號通路，可特異性激活TLR5，TLR5下游信號為MyD88依賴性并且與NF-κB或MAPK活化相關，MAPK通路受到多種因素的調控。
　　綜上所述，本論文的科學假設是:rFliC可通過擴增同種移植受體CD4+CD25+Treg細胞比例，提高Foxp3表達，增強其增殖能力及抑制性效

9、應，誘導同種移植免疫耐受。本研究試圖闡明rFliC對同種移植物生存狀態(tài)的影響，并且探討rFliC此種作用的內在機制、信號途徑及調控因素，從而為研究利用rFliC誘導移植免疫耐受提供理論和實驗依據(jù)，為臨床器官移植排斥的治療提供新的制劑，因此具有重要的理論和實際意義。
　　第一部分rFliC對小鼠同種皮膚移植物的影響及與TLR5表達的相關性
　　研究方法：
　　1、提取并純化基因重組鞭毛蛋白(rFliC)
　　利用攜

10、帶GST-FliC-Burkholderia pseudomallei基因的pGEX4T-2質粒及BL21E.coli感受態(tài)菌構建BL21 E.coli-GST-FliC菌株;抗生素抗性篩選后，對目標菌株進行活化及誘導表達，然后利用Glutathione Sepharose 4B凝膠提取基因重組鞭毛蛋白(rFliC)，并使用Toxin Eraser endotoxin removal resin去除細菌內毒素(Lipid polysac

11、chride，LPS)污染。
　　2、構建小鼠同種皮膚移植模型
　　無菌條件下將制備的C57BL/6小鼠背部全厚度皮片移植到BALB/c小鼠背部并進行包扎，移植術后第7日拆包。在移植術進行第-1、3、5、7、9、11日向實驗組小鼠i.p.注射rFliC(3mg/kg);同時設立等量PBS緩沖液注射組為對照組。
　　3、研究rFiiC對同種皮膚移植物生存狀態(tài)及生存期的影響
　　從拆包之日起，每日觀察兩組小鼠皮膚移植

12、物的生長狀態(tài)及排斥情況，記錄移植皮片排斥百分比及生存期。在PBS對照組小鼠的移植皮片完全排斥當日，脫頸椎處死兩組小鼠，完整取下供體皮片及受體移植床部位組織，進行甲醛固定并制備石蠟切片，應用HE染色觀察移植物組織病理情況。
　　4、檢測rFliC對同種皮膚移植物與移植受體TLR5表達的影響
　　在PBS對照組小鼠的移植皮片完全排斥當日，取受體移植床部位的移植皮片組織，進行甲醛固定并制備石蠟切片，應用抗-TLR5抗體進行免疫組化

13、染色觀察移植物TLR5表達情況。
　　研究結果：
　　1、PBS對照組小鼠的皮膚移植物較早出現(xiàn)硬化、結痂、皺縮，拆包后至完全排斥進程較快。與對照組相比，rFliC處理組小鼠的皮膚移植物生長狀況良好，排斥情況較輕，排斥進程較緩慢，皮膚移植物生存期明顯長于對照組(p＜0.05)。結果表示rFliC可以明顯延長小鼠同種皮膚移植存活期，改善移植物生存狀態(tài)。
　　2、移植物病理分析結果顯示:對照組小鼠移植皮片皺縮、變薄，表皮及真

14、皮明顯壞死，移植物與受體組織間連接疏松，受體組織內存在大量以單個核細胞浸潤為主的細胞浸潤;而rFliC處理組小鼠的皮膚移植物平展、厚實，表皮及真皮未顯示明顯壞死，移植物與受體組織間連接緊密，受體組織內的炎性細胞浸潤也較輕微。此結果進一步證實rFliC促進同種皮膚移植物生存。
　　3、移植物免疫組化染色結果顯示:與對照組相比，rFliC處理組小鼠皮膚移植物的TLR5被激活，呈高表達狀態(tài)，提示rFliC對同種皮膚移植物生存的影響可能與

15、TLR5激活相關。
　　第二部分rFliC對小鼠同種移植受體Treg細胞的影響
　　研究方法：
　　1、構建小鼠同種皮膚移植模型
　　建立小鼠同種皮膚移植模型，隨機分為rFliC注射組、對照組及TLR5阻斷組。rFliC組:在移植術進行第-1、3、5、7、9、11日向小鼠i.p.注射rFliC(3mg/kg)，對照組小鼠i.p.注射PBS緩沖液;TLR5阻斷組:在移植術進行第-1日向小鼠注射rFliC前1h，向小

16、鼠i.p.注射TLR5抗體（200μg/只），其它處理同rFliC組。
　　2、檢測移植受體CD4+CD25+Foxp3+細胞亞群比例
　　PBS對照組小鼠移植皮片完全排斥當日，脫頸椎法處死三組小鼠，制備脾細胞懸液及腋窩淋巴結細胞懸液，然后應用CD4、CD25、Foxp3單克隆抗體進行熒光染色，使用流式細胞儀檢測三組小鼠CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞在CD4+細胞中的比例。
　　3、檢測移植受體脾細胞Fox

17、p3表達狀況
　　在PBS對照組小鼠移植皮片完全排斥當日，脫頸椎處死三組小鼠，取出脾臟，進行甲醛固定并制備石蠟切片，應用抗-Foxp3抗體進行免疫組化染色檢測受體小鼠脾Foxp3表達情況。
　　4、檢測移植受體Treg相關分子表達
　　PBS對照組小鼠移植皮片完全排斥當日，脫頸椎處死三組小鼠，取出脾臟，制備脾細胞懸液并應用免疫磁珠分離CD4+CD25+Treg細胞。應用實時定量RT-PCR技術檢測TLR5、Foxp3、

18、TGF-β1及IL-10表達水平。應用Western blot技術檢測TLR5及Foxp3表達。
　　5、移植受體Treg細胞增殖實驗
　　PBS對照組小鼠移植皮片完全排斥當日，脫頸椎處死三組小鼠，取出脾臟，制備脾細胞懸液，并進一步分離CD4+CD25+Treg細胞。將三組Treg細胞分別培養(yǎng)4d后，向培養(yǎng)基內摻入3H-TdR，繼續(xù)孵育16h后，收集細胞，應用液體閃爍計數(shù)器檢測各組細胞dpm(Decay per minute

19、)計數(shù)。
　　6、移植受體Treg細胞抑制實驗
　　PBS對照組小鼠移植皮片完全排斥當日，脫頸椎處死三組小鼠，取出脾臟，制備脾細胞懸液，并進一步分離CD4+CD25+Treg細胞及CD4+CD25-Teff細胞（Effector T cell，效應T細胞），同時使用野生型BALB/c小鼠制備Teff細胞。分別將對照組、rFliC處理組及TLR5阻斷組小鼠Treg細胞培養(yǎng)3d，然后將對照組、rFliC處理組及野生型小鼠Teff

20、分別與三組Treg進行混合，繼續(xù)孵育24h后向培養(yǎng)基內摻入3H-TdR，孵育16h后，收集細胞，應用液體閃爍計數(shù)器檢測各組細胞dpm計數(shù)。
　　7、制備同種抗原
　　制備野生型B6小鼠脾細胞懸液后，加入40μg/ml絲裂霉素C避光孵育40min，PBS洗滌后，用培養(yǎng)液重懸，即為同種（異型）抗原遞呈細胞(APC)。
　　野生型B6小鼠的脾細胞進行超聲破碎后離心收集上清，即為可溶性同種（異型）抗原。
　　8、檢測體外

21、同種抗原刺激下Treg細胞相關分子表達
　　制備野生型BALB/c小鼠CD4+CD25+Treg細胞，加入同種抗原刺激后收集細胞，應用半定量RT-PCR技術檢測TLR5、Foxp3、TGF-β1及IL-10表達情況，應用Western blot技術檢測TLR5及Foxp3表達情況。TLR5阻斷組:將Treg細胞用TLR5阻斷抗體進行預處理。
　　9、體外同種抗原刺激Treg細胞增殖實驗
　　制備野生型BALB/c小鼠C

22、D4+CD25+Treg細胞，分別加入APC細胞、APC+rFliC或rFliC進行刺激后，摻入3H-TdR檢測細胞增殖水平。TLR5阻斷組:將Treg細胞用抗TLR5阻斷抗體進行預處理。
　　10、體外同種抗原刺激Treg細胞抑制功能實驗
　　制備野生型BALB/c小鼠CD4+CD25+Treg細胞及CD4+CD25-Teff細胞，首先對Treg細胞進行APC或APC+rFliC刺激，然后洗滌，再將Treg與Teff共培養(yǎng)

23、，最后檢測共培養(yǎng)細胞增殖水平。TLR5阻斷組:將Treg細胞應用阻斷抗體進行預處理。
　　研究結果：
　　1、rFliC處理組小鼠脾淋巴細胞及腋窩淋巴結細胞CD4+CD25+Foxp3+細胞亞群在CD4+T細胞中的比例均顯著高于對照組。TLR5阻斷組小鼠脾淋巴細胞及腋窩淋巴結細胞中三陽性Treg細胞比例均明顯低于rFliC處理組。結果表明rFliC可以擴增同種移植受體Treg細胞比例，此作用與TLR5途徑相關。
　　2

24、、三組小鼠脾免疫組化染色結果顯示:與PBS對照組相比，rFliC處理組小鼠Foxp3表達顯著增加，而TLR5阻斷組Foxp3表達與rFliC處理組相比受到明顯抑制。此結果表明，rFliC可通過TLR5相關性途徑激活小鼠同種移植受體Treg細胞，上調Foxp3表達。
　　3、應用qRT-PCR技術檢測移植受體Treg細胞TLR5、Foxp3、TGF-β1及IL-10的表達情況。結果顯示:rFliC處理組四種分子的mRNA表達與PBS

25、對照組相比均有顯著提高;而應用TLR5阻斷抗體之后，rFliC對四種分子表達的上調作用受到顯著抑制。各組小鼠Treg細胞表達TLR5和Foxp3的情況通過Western blot技術進行了驗證。以上結果表明rFliC對同種移植小鼠模型的刺激可增加Treg相關分子的表達，而此種作用與TLR5途徑相關，結果進一步證實了rFliC對移植受體Treg細胞的激活作用。
　　4、移植受體Treg細胞增殖實驗結果顯示:rFliC處理組小鼠Tre

26、g細胞增殖水平與PBS對照組相比顯著增高，而TLR5阻斷組小鼠Treg細胞的增殖水平相比rFliC處理組受到明顯抑制。此結果表明rFliC通過TLR5依賴性途徑上調移植受體Treg細胞的增殖功能。
　　5、移植受體Treg細胞與Teff細胞共培養(yǎng)結果顯示，三組Treg細胞中rFliC-Treg對Teff的抑制能力最強，而此作用在TLR5阻斷后受到明顯下調。以上結果表明rFliC對移植受體Treg細胞的功能起到激活上調作用，此作用與

27、TLR5途徑相關。
　　6、rFliC對體外同種抗原刺激的Treg細胞的分子表達及功能的影響與體內實驗結果一致，從體外進一步證實了rFliC對同種抗原刺激的Treg細胞的作用。
　　第三部分rFliC對同種抗原激活的Treg細胞Foxp3表達影響的分子機理與調控
　　研究方法：
　　1、檢測rFliC對Treg細胞JNK、p38MAPK信號的活化情況
　　應用同種抗原刺激野生型BALB/c小鼠CD4+CD2

28、5+Treg細胞后，加入rFliC進行梯度時間刺激，用Western blot檢測各時間點JNK及p38MAPK磷酸化情況。
　　2、檢測rFliC活化的Treg細胞JNK、p38MAPK信號與Foxp3表達的相關性
　　應用同種抗原刺激Treg細胞，阻斷JNK及p38MAPK信號，加入rFliC刺激后，Western blot檢測Foxp3蛋白表達情況。
　　3、檢測rFliC對Treg細胞PI3K-Akt信號的活化

29、情況
　　應用同種抗原刺激Treg細胞后，加入rFliC進行梯度時間刺激，用Western blot檢測各時間點Akt磷酸化情況。
　　4、檢測Treg細胞中rFliC激活的PI3K信號對p38MAPK活化的影響
　　應用同種抗原刺激Treg細胞，阻斷PI3K信號，加入rFliC刺激后，用Western blot檢測不同時間點p38MAPK磷酸化情況。
　　5、檢測Treg細胞中rFliC激活的PI3K信號與Fo

30、xp3表達的相關性
　　應用同種抗原刺激Treg細胞，阻斷PI3K信號，加入rFliC刺激，應用Western blot及RT-PCR檢測Foxp3表達情況;應用同種抗原刺激小鼠脾淋巴細胞，阻斷PI3K信號，加入rFliC刺激，應用流式細胞術檢測CD4+CD25+Foxp3+細胞在CD4+T細胞中的比例。
　　6、檢測Treg細胞中rFliC激活的PI3K及p38MAPK信號與Foxp3表達的相關性
　　應用同種抗原刺

31、激Treg細胞后，先阻斷p38信號，再阻斷PI3K信號，然后加入rFliC刺激，應用Western blot及RT-PCR檢測Foxp3表達情況;應用同種抗原刺激小鼠脾淋巴細胞后，先阻斷p38信號，再阻斷PI3K信號，加入rFliC刺激后應用流式細胞術檢測CD4+CD25+Foxp3+細胞在CD4+T細胞中的比例。
　　研究結果：
　　1、rFliC作用于同種抗原激活的Treg細胞，可活化JNK及p38MAPK信號。而p38

32、MAPK信號與rFliC引起的Foxp3表達上調相關，即rFliC對同種抗原激活Treg細胞Foxp3表達的作用通過rFliC-p38-Foxp3通路實現(xiàn)。
　　2、rFliC可以激活同種抗原刺激Treg細胞的PI3K-Akt信號。并且PI3K信號對p38MAPK活化具有負調節(jié)作用。
　　3、PI3K對rFliC-p38-Foxp3通路具有負調控作用，而調控方式通過抑制p38MAPK信號活化實現(xiàn)。
　　全文結論：

33、>　　1.rFliC體內應用可以明顯改善小鼠同種皮膚移植物生存狀態(tài)，延長移植物生存期，誘導同種移植免疫耐受。并且rFliC可激活移植物TLR5表達，提示rFliC誘導同種移植免疫耐受的作用與TLR5途徑相關。
　　2.rFliC可明顯提高同種移植受體CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞比例，上調Treg細胞相關分子Foxp3等表達水平，增強Treg細胞功能，并且這些作用都與TLR5途徑相關。提示rFliC誘導同種移植免疫耐受

34、的機制可能是通過TLR5相關途徑上調Treg細胞功能。
　　3.rFliC刺激Treg細胞后對Foxp3表達的上調可通過rFliC-p38MAPK-Foxp3通路實現(xiàn)，而PI3K可通過抑制p38信號活化對此通路起負調控作用。
　　論文創(chuàng)新點：
　　1.首次利用小鼠同種皮膚移植模型，證實rFliC可明顯延長小鼠同種皮膚移植物生存時間，誘導同種移植免疫耐受，從而為進一步研發(fā)誘導實體器官移植免疫耐受的新型制劑提供了實驗依據(jù)。

35、
　　2.首次證實rFliC可以提高小鼠同種移植受體CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞比例及功能，并且作用機制與TLR5途徑相關。為研究鞭毛蛋白誘導同種移植免疫耐受的細胞及分子機制提供了實驗基礎及理論依據(jù)。
　　3.首次證實rFliC上調Treg細胞Foxp3表達的作用與p38MAPK活化相關，即可通過rFliC-p38-Foxp3通路實現(xiàn)，證實了PI3K信號對此通路具有負調控作用。從而為研究鞭毛蛋白誘導同種移植免疫