骨髓腔內(nèi)骨髓移植誘導(dǎo)同種異體皮膚移植免疫耐受的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、【研究背景】
　　當(dāng)前救治大面積深度燒傷病人的主要困難在于自體的皮源嚴(yán)重不足，使得早期無法有效的封閉創(chuàng)面，而異體皮加微粒皮移植只能暫時覆蓋創(chuàng)面而不能長期成活，以致病人發(fā)生感染、膿毒癥，最后全身多器官出現(xiàn)衰竭而死亡。這些問題嚴(yán)重地制約了我們對大面積燒傷病人臨床治療水平的發(fā)展和提高。因此，誘導(dǎo)永久的免疫耐受，使得移植的異體皮甚至異種皮可以長期存活，就成為燒傷界當(dāng)前一個重要的臨床問題。
　　近來的一些研究發(fā)現(xiàn)，造血干細(xì)胞移植后形成

2、混合嵌合體可誘導(dǎo)供體產(chǎn)生特異性免疫耐受，并分別在動物實(shí)驗(yàn)及臨床應(yīng)用中得到了證實(shí)。在誘導(dǎo)混合嵌合體的過程中，無論是通過清髓性還是非清髓性方案，受體的預(yù)處理都離不開細(xì)胞毒性藥物或是全身照射，以提高造血干細(xì)胞移植的成活率，這就在很大程度上限制了該技術(shù)的臨床推廣和應(yīng)用。
　　燒傷后的病人本身免疫力下降，尤其是T細(xì)胞免疫的抑制，使T細(xì)胞對異體抗原呈低反應(yīng)性，不適合使用強(qiáng)烈的損傷性預(yù)處理，因此，必須找尋一種溫和的預(yù)處理方式。間充質(zhì)干細(xì)胞同時具

3、有免疫調(diào)節(jié)和支持造血重建的功能，大量臨床及動物實(shí)驗(yàn)均表明它可以移植免疫排斥反應(yīng)的發(fā)生，及治療激素?zé)o效的移植物抗宿主病。
　　本實(shí)驗(yàn)擬通過骨髓腔內(nèi)骨髓移植聯(lián)合間充質(zhì)干細(xì)胞共移植的方法誘導(dǎo)供體特異性免疫耐受，并延長異體皮膚的存活時間。
　　【研究目的】
　　探討在不進(jìn)行清髓或非清髓預(yù)處理的情況下，利用骨髓腔內(nèi)骨髓移植聯(lián)合間充質(zhì)干細(xì)胞共輸注，形成穩(wěn)定的混合嵌合體，誘導(dǎo)同種異體皮膚移植物免疫耐受的可行性。
　　【研究內(nèi)容

4、】
　　1．體外分離小鼠不同組織來源的間充質(zhì)干細(xì)胞，擴(kuò)增培養(yǎng)，觀察其形態(tài)，細(xì)胞增殖情況及多向誘導(dǎo)分化的能力。
　　2．取小鼠不同組織來源的間充質(zhì)干細(xì)胞（絲裂霉素C處理）與同種異基因淋巴細(xì)胞（植物血凝素刺激）共培養(yǎng)，通過MTT比色法檢測淋巴細(xì)胞的增殖情況，Western-Blot檢測foxp3蛋白含量的變化，實(shí)時定量RT-PCR檢測foxp3 mRNA的變化，從而探討其可能的作用機(jī)制。
　　3．在小鼠及兔動物模型中采用骨

5、髓腔內(nèi)骨髓移植聯(lián)合間充質(zhì)干細(xì)胞共輸注誘導(dǎo)穩(wěn)定混合嵌合體的生成，并行異體皮移植驗(yàn)證免疫耐受的形成，觀察皮片存活時間，檢測體內(nèi)嵌合體的情況，混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)，Western-Blot檢測foxp3蛋白含量的變化，實(shí)時定量RT-PCR檢測foxp3 mRNA的變化。
　　【研究結(jié)果】
　　1．不同組織來源的間充質(zhì)干細(xì)胞均可分離培養(yǎng)，體外擴(kuò)增，形態(tài)呈梭形，細(xì)胞生長曲線呈S形，細(xì)胞經(jīng)成脂誘導(dǎo)，油紅O染色后可見紅色脂滴，經(jīng)成骨誘導(dǎo)，堿性

6、磷酸酶染色后見堿性磷酸酶表達(dá)陽性。
　　2．不同組織來源的間充質(zhì)干細(xì)胞體外均可抑制異基因淋巴細(xì)胞的增殖，且foxp3的蛋白及mRNA的表達(dá)均明顯上升。
　　3．實(shí)驗(yàn)組小鼠移植皮片存活時間明顯延長，其中，存活時間最長的已超過100天。但在兔的移植模型中，實(shí)驗(yàn)組皮片存活時間與對照組無明顯差別。
　　【研究結(jié)論】
　　1．間充質(zhì)干細(xì)胞易于體外分離培養(yǎng)，可以穩(wěn)定傳代擴(kuò)增至足夠數(shù)量用于骨髓移植前的預(yù)處理。
　　2．間