胸腺移植誘導小鼠半相合骨髓移植后免疫耐受及促進免疫重建的研究.pdf

1、研究背景和目的 造血干細胞移植(HSCT)尤其是異基因HSCT(allo-HSCT)現(xiàn)廣泛應用于血液腫瘤或非血液惡性腫瘤、再生障礙性貧血、某些遺傳性疾病等的治療。由于目前尚未解決的高移植物抗宿主病(GVHD)和高機會性感染率與致死率，致使allo-HSCT后患者的長期生存率僅在50％左右，同時因移植后GVHD和機會性感染而影響患者的生存質量。解決allo-HSCT后GVHD和降低機會性感染的發(fā)生率與致死率是提高allo-HSCT

2、后長期無病生存和生活質量的關鍵。在allo-HSCT中，誘導供者T細胞對受者抗原產生免疫耐受及促進移植后T細胞的重建，是目前提高allo-HSCT后長期無病生存和生活質量的關鍵。 在個體發(fā)育過程中，T細胞獲得對自身抗原的免疫耐受和T細胞受體(TCR)庫的形成主要在胸腺完成，它依賴于胸腺上皮細胞及微環(huán)境。在不同年齡的allo-HSCT患者中觀察到，隨著受者年齡增長，GVHD的發(fā)生率和機會性感染率均增高，免疫重建延遲越明顯。allo

3、-HSCT后兒童患者可在移植后大約一年內完成以T細胞為基礎的免疫重建，成人則需要數(shù)年甚至終生不能重建完整的T細胞庫，這些都與隨著年齡的增長，胸腺逐漸萎縮，對供者T細胞的修飾作用(胸腺選擇)降低有關。allo-HSCT后供者T細胞的重建主要通過胸腺依賴途徑和胸腺非依賴途徑完成。allo-HSCT后受者體內存在5類不同類型的T細胞群落，其中4類是供者來源的，包括經胸腺途徑由供者T干/祖細胞而新近生成的T細胞、移植物中含有的非異基因反應性成熟

4、T細胞、移植物中含有的異基因反應性T細胞及少量的由供者T干/祖細胞經胸腺外途徑新近生成的T細胞；第5類是受者體內殘留的未被預處理清除的T細胞。供者來源的經造血干細胞分化的初始T細胞(Na(i)veTcell)通過胸腺依賴途徑重建永久的T細胞免疫，同時經胸腺修飾后選擇性去除自身反應性T細胞克隆而獲得對受者抗原的免疫耐受；而供者來源的成熟T細胞則經胸腺非依賴途徑在外周擴增，重建移植后的早期免疫，而且經胸腺非依賴途徑產生的T細胞僅使供者獲得移

5、植后短暫的早期免疫重建和不能重建完整的T細胞庫，該類未經胸腺修飾的T細胞不能形成對受者抗原的免疫耐受，繼而參與GVHD的發(fā)生與發(fā)展。 近年來在異體實體器官移植免疫耐受研究中，為提高免疫耐受降低移植后對移植器官的排斥，在動物實驗及人類前瞻性研究中采用實體器官和胸腺聯(lián)合移植方案，結果顯示能明顯降低受者對移植物的排斥反應和促進實體器官移植后T細胞的重建。 本研究的目的在于通過建立H-2半相合胎胸腺移植聯(lián)合骨髓移植(BMT)模型

6、，使移植胸腺修飾供者和受者T細胞，探討胸腺移植對H-2半相合BMT后GVHD，小鼠累積生存率以及對移植后外周血T細胞重建的影響，為臨床在allo-HSCT包括實體器官移植中誘導免疫耐受、預防GVHD、促進免疫重建降低機會性感染率提供理論基礎。 方法 1、建立C57BL/6→CB6F1小鼠H-2半相合骨髓移植GVHD模型。 2、建立C57BL/6→CB6F1小鼠H-2半相合胎小鼠胸腺移植模型。 3、在建立H

7、-2半相合骨髓移植GVHD模型及H-2半相合胎小鼠胸腺移植模型的基礎上，進行H-2半相合胎小鼠胸腺移植聯(lián)合H-2半相合BMT，將實驗對象分為移植胎胸腺組(實驗組，EG)和未移植胎胸腺組(對照組，CG)，觀察二者移植后小鼠GVHD評分及長期生存情況。 4、H-2半相合胎小鼠胸腺移植聯(lián)合H-2半相合BMT后1、2、3月，利用流式細胞術(FACS)檢測受體鼠外周血中CD3+CD4+T和CD3+CD8+T細胞的重建情況。 5、移

8、植后3個月，利用組織學和免疫組織化學技術，觀察移植胸腺的結構以及供者MHCⅠ類抗原在在胸腺移植物內的表達情況。 6、利用單向混合淋巴細胞反應實驗，檢測受者脾細胞對異體淋巴細胞的反應性，以期了解胸腺移植后受者是否具有抗原特異性的免疫耐受。 7、統(tǒng)計學分析 用SPSS13.0軟件包處理，移植后T細胞重建采用重復測量的方差分析；H-2半相合移植后兩組小鼠的GVHD積分采用獨立樣本t檢驗；對MLR的各項指標用One-wa

9、yANOVA檢驗；對小鼠生存時間進行Kaplan-Meier生存模型分析，并繪制生存時間曲線。P≤0.05表示差異顯有著性意義。 結果 1、采用全身照射(TBI，劑量8.5Gy)+環(huán)磷酰胺(CY，200mg/kg，-1d，腹腔注射)預處理方案，移植5×106個骨髓MNCs及3×107個的脾細胞后，H-2半相合受鼠可出現(xiàn)典型的GVHD表現(xiàn)。 2、在TBI+CY預處理方案和移植后間斷使用甲基強的松龍的條件下，H-2半

10、相合胎胸腺可在受者體內繼續(xù)發(fā)育生長，移植后3個月時，最終在腎被膜下形成具有典型胸腺結構的組織，經免疫組化證明為供者來源。 3、EG和CG小鼠的GVHD評分在移植后第12周前差異均無顯著性意義，自第13周EG的GVHD評分開始明顯低于CG。停用甲基強的松龍后，EG有輕度非致死性GVHD，移植后第110天仍有42％(5/12)的小鼠存活，而CG的GVHD十分嚴重，移植后第110天全部死亡，兩組累積生存率差異有顯著性意義(LogRan

11、k=6.562，P=0.010)。 4、無論是半相合還是同系BMT后CD3+CD4+T和CD3+CD8+T細胞百分數(shù)，移植后不同時間點的重建在EG和CG之間的差異均無顯著性意義，但隨著時間的推移，在二者CD3+CD4+T和CD3+CD8+T細胞百分數(shù)均進行性增高。 5、單向MLR實驗結果顯示胎胸腺移植后受者的脾細胞對胸腺供體來源的C57BL/6小鼠的脾細胞表現(xiàn)為低反應，即對供者來源的脾細胞產生免疫耐受，而對非胸腺供體來源

12、BALB/c及KM小鼠的脾細胞則有較高的反應性。 討論 大多數(shù)研究表明，若要將胎豬胸腺成功植入免疫健全的B6小鼠中，受者必須進行胸腺切除，同時清除體內成熟的T細胞和NK細胞。Nobori等在切除豬胸腺3w后移植帶血管蒂的異基因豬胸腺及心臟，并在移植當天開始使用FK506進行免疫抑制治療，結果表明血管蒂的異基因豬胸腺可在豬體內存活，并誘導機體對移植的異基因心臟形成耐受，這表明為完成異基因胸腺的成功移植，對受者條件的限制不是

13、一成不變的。本實驗采用CB6F1小鼠作為胸腺移植的受者，與其H-2半相合的C57BL/6小鼠作為胎胸腺的供者進行移植。考慮到二者間的MHC為半相合的，其對胸腺的排斥效應可能較異種移植要小，我們在給予TBI(8.5Gy)+CY的預處理基礎上，不切除CB6F1小鼠胸腺、不使用抗CD4和抗CD8單克隆抗體，而直接將H-2半相合的C57BL/6胎小鼠胸腺移植到CB6F1小鼠左腎被膜下，并在移植后使用甲基強的松龍抑制受者T細胞的功能，結果同樣成功

14、建立了H-2半相合胎胸腺移植模型。 我們在H-2半相合allo-HSCT的同時移植與供者同系的胎小鼠胸腺，結果表明移植后GVHD明顯減輕，小鼠累積生存明顯延長，同時通過MLR證實胎胸腺移植可誘導對供體抗原特異性的免疫耐受。但是本研究并沒有發(fā)現(xiàn)胸腺移植可以促進移植后的T細胞重建，其可能的原因有：(1)我們在研究中只檢測了CD3+CD4+T和CD3+CD8+T細胞占外周血淋巴細胞的百分比，而沒有測定其絕對值；(2)免疫重建指標我們只

15、選擇了CD3+CD4+T和CD3+CD8+T細胞兩個指標，即便是這兩個指標之間無差異，但其他指標如CD4+CD45RA+、CD8+CD45RA+等指標間可能存在差異。為了進一步測定移植的胸腺對免疫重建的影響，可測定反應胸腺輸出功能的T細胞受體基因重排刪除環(huán)(TRECs)等。 結論 1、成功建立了H-2半相合骨髓移植GVHD模型和H-2半相合胎小鼠胸腺移植模型。 2、H-2半相合胎胸腺移植聯(lián)合BMT，可明顯降低移植