胸腺移植誘導(dǎo)小鼠半相合骨髓移植后免疫耐受及促進(jìn)免疫重建的研究.pdf

1、研究背景和目的 造血干細(xì)胞移植(HSCT)尤其是異基因HSCT(allo-HSCT)現(xiàn)廣泛應(yīng)用于血液腫瘤或非血液惡性腫瘤、再生障礙性貧血、某些遺傳性疾病等的治療。由于目前尚未解決的高移植物抗宿主病(GVHD)和高機(jī)會(huì)性感染率與致死率，致使allo-HSCT后患者的長(zhǎng)期生存率僅在50％左右，同時(shí)因移植后GVHD和機(jī)會(huì)性感染而影響患者的生存質(zhì)量。解決allo-HSCT后GVHD和降低機(jī)會(huì)性感染的發(fā)生率與致死率是提高allo-HSCT

2、后長(zhǎng)期無(wú)病生存和生活質(zhì)量的關(guān)鍵。在allo-HSCT中，誘導(dǎo)供者T細(xì)胞對(duì)受者抗原產(chǎn)生免疫耐受及促進(jìn)移植后T細(xì)胞的重建，是目前提高allo-HSCT后長(zhǎng)期無(wú)病生存和生活質(zhì)量的關(guān)鍵。 在個(gè)體發(fā)育過(guò)程中，T細(xì)胞獲得對(duì)自身抗原的免疫耐受和T細(xì)胞受體(TCR)庫(kù)的形成主要在胸腺完成，它依賴于胸腺上皮細(xì)胞及微環(huán)境。在不同年齡的allo-HSCT患者中觀察到，隨著受者年齡增長(zhǎng)，GVHD的發(fā)生率和機(jī)會(huì)性感染率均增高，免疫重建延遲越明顯。allo

3、-HSCT后兒童患者可在移植后大約一年內(nèi)完成以T細(xì)胞為基礎(chǔ)的免疫重建，成人則需要數(shù)年甚至終生不能重建完整的T細(xì)胞庫(kù)，這些都與隨著年齡的增長(zhǎng)，胸腺逐漸萎縮，對(duì)供者T細(xì)胞的修飾作用(胸腺選擇)降低有關(guān)。allo-HSCT后供者T細(xì)胞的重建主要通過(guò)胸腺依賴途徑和胸腺非依賴途徑完成。allo-HSCT后受者體內(nèi)存在5類不同類型的T細(xì)胞群落，其中4類是供者來(lái)源的，包括經(jīng)胸腺途徑由供者T干/祖細(xì)胞而新近生成的T細(xì)胞、移植物中含有的非異基因反應(yīng)性成熟

4、T細(xì)胞、移植物中含有的異基因反應(yīng)性T細(xì)胞及少量的由供者T干/祖細(xì)胞經(jīng)胸腺外途徑新近生成的T細(xì)胞；第5類是受者體內(nèi)殘留的未被預(yù)處理清除的T細(xì)胞。供者來(lái)源的經(jīng)造血干細(xì)胞分化的初始T細(xì)胞(Na(i)veTcell)通過(guò)胸腺依賴途徑重建永久的T細(xì)胞免疫，同時(shí)經(jīng)胸腺修飾后選擇性去除自身反應(yīng)性T細(xì)胞克隆而獲得對(duì)受者抗原的免疫耐受；而供者來(lái)源的成熟T細(xì)胞則經(jīng)胸腺非依賴途徑在外周擴(kuò)增，重建移植后的早期免疫，而且經(jīng)胸腺非依賴途徑產(chǎn)生的T細(xì)胞僅使供者獲得移

5、植后短暫的早期免疫重建和不能重建完整的T細(xì)胞庫(kù)，該類未經(jīng)胸腺修飾的T細(xì)胞不能形成對(duì)受者抗原的免疫耐受，繼而參與GVHD的發(fā)生與發(fā)展。 近年來(lái)在異體實(shí)體器官移植免疫耐受研究中，為提高免疫耐受降低移植后對(duì)移植器官的排斥，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及人類前瞻性研究中采用實(shí)體器官和胸腺聯(lián)合移植方案，結(jié)果顯示能明顯降低受者對(duì)移植物的排斥反應(yīng)和促進(jìn)實(shí)體器官移植后T細(xì)胞的重建。 本研究的目的在于通過(guò)建立H-2半相合胎胸腺移植聯(lián)合骨髓移植(BMT)模型

6、，使移植胸腺修飾供者和受者T細(xì)胞，探討胸腺移植對(duì)H-2半相合BMT后GVHD，小鼠累積生存率以及對(duì)移植后外周血T細(xì)胞重建的影響，為臨床在allo-HSCT包括實(shí)體器官移植中誘導(dǎo)免疫耐受、預(yù)防GVHD、促進(jìn)免疫重建降低機(jī)會(huì)性感染率提供理論基礎(chǔ)。 方法 1、建立C57BL/6→CB6F1小鼠H-2半相合骨髓移植GVHD模型。 2、建立C57BL/6→CB6F1小鼠H-2半相合胎小鼠胸腺移植模型。 3、在建立H

7、-2半相合骨髓移植GVHD模型及H-2半相合胎小鼠胸腺移植模型的基礎(chǔ)上，進(jìn)行H-2半相合胎小鼠胸腺移植聯(lián)合H-2半相合BMT，將實(shí)驗(yàn)對(duì)象分為移植胎胸腺組(實(shí)驗(yàn)組，EG)和未移植胎胸腺組(對(duì)照組，CG)，觀察二者移植后小鼠GVHD評(píng)分及長(zhǎng)期生存情況。 4、H-2半相合胎小鼠胸腺移植聯(lián)合H-2半相合BMT后1、2、3月，利用流式細(xì)胞術(shù)(FACS)檢測(cè)受體鼠外周血中CD3+CD4+T和CD3+CD8+T細(xì)胞的重建情況。 5、移

8、植后3個(gè)月，利用組織學(xué)和免疫組織化學(xué)技術(shù)，觀察移植胸腺的結(jié)構(gòu)以及供者M(jìn)HCⅠ類抗原在在胸腺移植物內(nèi)的表達(dá)情況。 6、利用單向混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)受者脾細(xì)胞對(duì)異體淋巴細(xì)胞的反應(yīng)性，以期了解胸腺移植后受者是否具有抗原特異性的免疫耐受。 7、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用SPSS13.0軟件包處理，移植后T細(xì)胞重建采用重復(fù)測(cè)量的方差分析；H-2半相合移植后兩組小鼠的GVHD積分采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；對(duì)MLR的各項(xiàng)指標(biāo)用One-wa

9、yANOVA檢驗(yàn)；對(duì)小鼠生存時(shí)間進(jìn)行Kaplan-Meier生存模型分析，并繪制生存時(shí)間曲線。P≤0.05表示差異顯有著性意義。 結(jié)果 1、采用全身照射(TBI，劑量8.5Gy)+環(huán)磷酰胺(CY，200mg/kg，-1d，腹腔注射)預(yù)處理方案，移植5×106個(gè)骨髓MNCs及3×107個(gè)的脾細(xì)胞后，H-2半相合受鼠可出現(xiàn)典型的GVHD表現(xiàn)。 2、在TBI+CY預(yù)處理方案和移植后間斷使用甲基強(qiáng)的松龍的條件下，H-2半

10、相合胎胸腺可在受者體內(nèi)繼續(xù)發(fā)育生長(zhǎng)，移植后3個(gè)月時(shí)，最終在腎被膜下形成具有典型胸腺結(jié)構(gòu)的組織，經(jīng)免疫組化證明為供者來(lái)源。 3、EG和CG小鼠的GVHD評(píng)分在移植后第12周前差異均無(wú)顯著性意義，自第13周EG的GVHD評(píng)分開始明顯低于CG。停用甲基強(qiáng)的松龍后，EG有輕度非致死性GVHD，移植后第110天仍有42％(5/12)的小鼠存活，而CG的GVHD十分嚴(yán)重，移植后第110天全部死亡，兩組累積生存率差異有顯著性意義(LogRan

11、k=6.562，P=0.010)。 4、無(wú)論是半相合還是同系BMT后CD3+CD4+T和CD3+CD8+T細(xì)胞百分?jǐn)?shù)，移植后不同時(shí)間點(diǎn)的重建在EG和CG之間的差異均無(wú)顯著性意義，但隨著時(shí)間的推移，在二者CD3+CD4+T和CD3+CD8+T細(xì)胞百分?jǐn)?shù)均進(jìn)行性增高。 5、單向MLR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示胎胸腺移植后受者的脾細(xì)胞對(duì)胸腺供體來(lái)源的C57BL/6小鼠的脾細(xì)胞表現(xiàn)為低反應(yīng)，即對(duì)供者來(lái)源的脾細(xì)胞產(chǎn)生免疫耐受，而對(duì)非胸腺供體來(lái)源

12、BALB/c及KM小鼠的脾細(xì)胞則有較高的反應(yīng)性。 討論 大多數(shù)研究表明，若要將胎豬胸腺成功植入免疫健全的B6小鼠中，受者必須進(jìn)行胸腺切除，同時(shí)清除體內(nèi)成熟的T細(xì)胞和NK細(xì)胞。Nobori等在切除豬胸腺3w后移植帶血管蒂的異基因豬胸腺及心臟，并在移植當(dāng)天開始使用FK506進(jìn)行免疫抑制治療，結(jié)果表明血管蒂的異基因豬胸腺可在豬體內(nèi)存活，并誘導(dǎo)機(jī)體對(duì)移植的異基因心臟形成耐受，這表明為完成異基因胸腺的成功移植，對(duì)受者條件的限制不是

13、一成不變的。本實(shí)驗(yàn)采用CB6F1小鼠作為胸腺移植的受者，與其H-2半相合的C57BL/6小鼠作為胎胸腺的供者進(jìn)行移植。考慮到二者間的MHC為半相合的，其對(duì)胸腺的排斥效應(yīng)可能較異種移植要小，我們?cè)诮o予TBI(8.5Gy)+CY的預(yù)處理基礎(chǔ)上，不切除CB6F1小鼠胸腺、不使用抗CD4和抗CD8單克隆抗體，而直接將H-2半相合的C57BL/6胎小鼠胸腺移植到CB6F1小鼠左腎被膜下，并在移植后使用甲基強(qiáng)的松龍抑制受者T細(xì)胞的功能，結(jié)果同樣成功

14、建立了H-2半相合胎胸腺移植模型。 我們?cè)贖-2半相合allo-HSCT的同時(shí)移植與供者同系的胎小鼠胸腺，結(jié)果表明移植后GVHD明顯減輕，小鼠累積生存明顯延長(zhǎng)，同時(shí)通過(guò)MLR證實(shí)胎胸腺移植可誘導(dǎo)對(duì)供體抗原特異性的免疫耐受。但是本研究并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)胸腺移植可以促進(jìn)移植后的T細(xì)胞重建，其可能的原因有：(1)我們?cè)谘芯恐兄粰z測(cè)了CD3+CD4+T和CD3+CD8+T細(xì)胞占外周血淋巴細(xì)胞的百分比，而沒(méi)有測(cè)定其絕對(duì)值；(2)免疫重建指標(biāo)我們只

15、選擇了CD3+CD4+T和CD3+CD8+T細(xì)胞兩個(gè)指標(biāo)，即便是這兩個(gè)指標(biāo)之間無(wú)差異，但其他指標(biāo)如CD4+CD45RA+、CD8+CD45RA+等指標(biāo)間可能存在差異。為了進(jìn)一步測(cè)定移植的胸腺對(duì)免疫重建的影響，可測(cè)定反應(yīng)胸腺輸出功能的T細(xì)胞受體基因重排刪除環(huán)(TRECs)等。 結(jié)論 1、成功建立了H-2半相合骨髓移植GVHD模型和H-2半相合胎小鼠胸腺移植模型。 2、H-2半相合胎胸腺移植聯(lián)合BMT，可明顯降低移植