Toll樣受體在誘導小鼠小腸移植免疫耐受中的作用的實驗研究.pdf

1、第一部分小鼠異位小腸移植模型的建立。
　　 目的：建立穩(wěn)定的小鼠異位小腸移植模型。
　　 方法：采用小腸供體的門靜脈(Portal vein，PV)與受體下腔靜脈(Inferior vena cava，IVC)端側吻合，供體帶主動脈片的腸系膜上動脈(Superior mesenteric artery，SMA)與受體腹主動脈端側吻合，供體近端腸管結扎，遠端與受體空腸端側吻合的方式建立異位小腸移植模型。選用C57BL/6小

2、鼠做供體和BALB/c小鼠作受體進行同種異基因型異位節(jié)段性小腸移植(Small bowel transplantation，SBT)。術后禁食3天，不禁飲，每天分兩次經皮下分別給予5％葡萄糖生理鹽水2ml，術后不使用抗生素和免疫抑制劑。小鼠存活超過5天認為手術成功。
　　 結果：建模初期共完成50例，僅有9例完成了手術全過程，其余41例均在手術過程中死亡，死亡原因為動脈吻合口血栓形成20例，大出血致出血性休克8例，門靜脈吻合口血

3、栓形成5例，吻合后血管狹窄3例，麻醉意外3例，術后腹腔內感染1只，原因不明1例。建模成熟穩(wěn)定期共完成60例定型手術，供體手術時間37.18±5.40min，熱缺血時間約0.5min，供體腸段腸系膜上動脈組織片修整時間為3.58±0.52min，供體冷保存時間為29.76±3.22min，受體手術時間80.28±2.25min，其中腹主動脈及下腔靜脈阻斷時間為38.15±2.71min，靜脈吻合時間11.03±0.67min，動脈吻合時間

4、16.32±1.60min，成活小鼠受體手術平均出血量約0.2ml。術后24h存活率為80％(48/60)，術后5天生存率為70％(42/60)。手術失敗的18只小鼠主要死亡原因為動脈吻合口血栓形成8例，動脈吻合口部位狹窄4例，吻合口出血導致出血性休克4只，術后腹腔內感染1只，原因不明1例。
　　 結論：
　　 1、采用改良方法建立的小鼠異位小腸移植模型穩(wěn)定可靠，可為后繼實驗研究提供基礎；
　　 2、小鼠小腸移植

5、手術難度大，良好的供體腸段的獲取、高質量的血管吻合及供、受體補液是提高小鼠小腸移植手術成功率的關鍵。
　　 第二部分小鼠小腸移植排斥反應的觀察。
　　 目的：探討各種免疫細胞及細胞因子在小鼠小腸移植排斥反應中的作用及可能機制，尋找反映排斥反應的指標。
　　 方法：供體為C57BL/6小鼠或BALB/c小鼠，受體為BALB/c小鼠，均為雄性，將實驗動物隨機分為4組，n=6：A組為BALB/c→BALB/c組，術后(

6、Post operation day，POD)11天處死；B組為C57BL/6→BALB/c組，POD3處死；C組為C57BL/6→BALB/c組，POD7處死；D組為C57BL/6→BALB/c組，POD11處死。采用前述方式建立小鼠異位小腸移植模型，于術后相應天數(shù)獲取標本。稱取受體脾臟重量并分離脾臟細胞，ELISA法檢測血清IL-10、IFN-γ和IL-17濃度水平，HE(Hematoxylin-Eosin)染色觀察移植小腸病理變化

7、，流式細胞技術檢測受體小鼠脾臟及移植小腸內浸潤細胞中各種細胞亞型。
　　 結果：移植小腸組織病理學檢測發(fā)現(xiàn)，A組無排斥反應發(fā)生，B組為輕度排斥反應，C組為中度排斥反應，D組為重度排斥反應；血清中IL-10、IL-17水平在各組間均具有顯著差異(P<0.05)，IL-10在A、B、C、D組中依次降低，而IL-17則相反，在A、B、C、D組中依次增高；血清中IFN-γ水平，A組與B組無顯著差異(P>0.05)，B、C、D組間均有顯著

8、差異(P<0.05)，在B、C、D組中依次增高；脾臟重量及其細胞數(shù)，各組間均具有顯著差異(P<0.05)，在A、B、C、D組中依次增高；脾臟中T細胞與B細胞比例，A組與B組均無顯著差異(P>0.05)，B、C、D組間均具有顯著差異(P<0.05)，在B、C、D組中均依次降低；脾臟中中性粒細胞比例在各組間均有顯著差異(P<0.05)，在A、B、C、D組中依次增高；脾臟T細胞中CD4+T細胞比例，A組與B組、C組與D組均無顯著差異(P>0.

9、05)，C組較B組顯著降低(P<0.05)；脾臟T細胞中CD8+T細胞比例，A組與B組、C組與D組均無顯著差異(P>0.05)，C組較B組顯著增高(P<0.05)；脾臟T細胞中CD4-CD8-T細胞比例，A組與B組無顯著差異(P>0.05)，B、C、D組間均具有顯著差異(P<0.05)，在B、C、D組中依次增高；脾臟CD4+T細胞中Th1細胞比例和CD8+T細胞中Tc1細胞比例，A組與B組均無顯著差異(P>0.05)，B、C、D組間均具

10、有顯著差異(P<0.05)，在B、C、D組中均依次增高；脾臟CD4+T細胞中Th2細胞與Th17細胞比例，各組間均具有顯著差異(P<0.05)，Th2細胞在A、B、C、D組中依次降低；而Th17細胞則相反，在A、B、C、D組中依次增高；移植小腸浸潤細胞中T細胞比例，A、B、C組間均具有顯著差異(P<0.05)，在A、B、C組中依次降低，C組與D組無顯著差異(P>0.05)；移植小腸浸潤細胞中B細胞及中性粒細胞比例在各組間均具有顯著差異(

11、P<0.05)，B細胞在A、B、C、D組中依次降低，中性粒細胞則在A、B、C、D組中依次增高；移植小腸浸潤T細胞中CD4+T細胞與CD8+T細胞比例在各組間均具有顯著差異(P<0.05)，CD4+T細胞在A、B、C、D組中依次降低，CD8+T細胞則在A、B、C、D組中依次增高；移植小腸浸潤T細胞中CD4-CD8-T細胞比例，在A、B、C、D組間均無顯著差異(P>0.05)；移植小腸浸潤CD4+T細胞中Th1、Th17細胞比例及浸潤CD8

12、+T細胞中Tc1細胞比例，各組間均具有顯著差異(P<0.05)，在A、B、C、D組中均依次增高；移植小腸浸潤CD4+T細胞中Th2細胞比例，A組與B組無顯著差異(P>0.05)，B、C、D組間均具有顯著差異(P<0.05)，在B、C、D組中依次降低。
　　 結論：
　　 1、小腸移植術后排斥反應是以T淋巴細胞介導的細胞免疫為中心的多種免疫細胞及細胞因子參與的復雜過程；
　　 2、Th1、Th17及Tc1細胞參與了

13、移植后排斥反應，其細胞數(shù)量及相應細胞因子IFN-γ和IL-17濃度可作為反映排斥反應的指標；
　　 3、Th2細胞及其細胞因子IL-10具有免疫調節(jié)作用，可誘導免疫耐受。
　　 第三部分 Toll樣受體在小鼠小腸移植排斥反應和誘導免疫耐受中的作用及其機制的研究。
　　 目的：研究Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)在小腸移植排斥反應中的作用及可能機制，探討在小腸移植中通過阻斷TLRs

14、信號傳導通路實現(xiàn)特異性免疫耐受的可能性及其可能機制。
　　 方法：供體為C57BL/6小鼠，受體為野生型或MyD88-/-BALB/c小鼠，均為雄性，將實驗動物隨機分為4組：A組為C57BL/6→BALB/c組，POD7處死；B組為C57BL/6→MyD88-/-BALB/c組，POD7處死；C組為C57BL/6→BALB/c組，POD11處死；D組為C57BL/6→MyD88-/-BALB/c組，POD11處死。采用前述方式建

15、立小鼠異位小腸移植模型，于術后相應天數(shù)獲取標本。各組分別重復7次實驗后，其中1次取受體脾臟行免疫組織化學(Immunohistochemistry，IHC)染色，6次行其余實驗，實驗結果取均值(n=6)。稱取受體脾臟重量并分離脾臟細胞，ELISA法檢測血清IL-10、IFN-γ和IL-17濃度水平，HE染色觀察移植小腸病理變化，流式細胞技術檢測受體小鼠脾臟及移植小腸內浸潤細胞中各種細胞亞型，同時獲取脾臟細胞行混合淋巴細胞培養(yǎng)(Mixed

16、 lymphocytes reaction，MLR)。
　　 結果：移植小腸組織病理學檢測發(fā)現(xiàn)，A組發(fā)生中度排斥反應，B組為輕度排斥反應，C組為重度排斥反應，D組為輕-中度排斥反應；血清中IL-10水平，B組較A組、D組較C組均顯著增高(P<0.05)；血清中IFN-γ與IL-17水平，B組較A組、D組較C組均顯著降低(P<0.05)；受體脾臟重量及其細胞數(shù)，B組較A組、D組較C組均顯著降低(P<0.05)；脾臟T細胞和移植小腸

17、浸潤T細胞中調節(jié)性T細胞(Regulatory T cell，Treg)比例，B組較A組、D組較C組均顯著增高(P<0.05)；移植小腸浸潤T細胞中CD4+T細胞比例，B組較A組、D組較C組均顯著增高(P<0.05)；移植小腸浸潤T細胞中CD8+T細胞比例，B組較A組、D組較C組均顯著降低(P<0.05)；移植小腸浸潤T細胞中CD4-CD8-T細胞比例，B組較A組、D組較C組均無顯著差異(P>0.05)；脾臟和移植小腸浸潤CD4+T細胞

18、中Th1、Th17細胞比例及CD8+T細胞中Tc1細胞比例，B組較A組、D組較C組均顯著降低(P<0.05)；脾臟和移植小腸浸潤CD4+T細胞中Th2細胞比例，B組較A組、D組較C組均顯著增高(P<0.05)；脾臟行Foxp3IHC染色計數(shù)Foxp3陽性細胞數(shù)目，B組較A組、D組較C組均顯著增高(P<0.05)；MLR示刺激指數(shù)，B組較A組、D組較C組均顯著降低(P<0.05)。
　　 結論：
　　 1、TLRs在小腸移