KLF2在內(nèi)膜增生組織中的表達(dá)及作用機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　建立大鼠主動(dòng)脈球囊損傷動(dòng)物模型，觀察主動(dòng)脈球囊損傷后內(nèi)膜增生的發(fā)生、發(fā)展情況，檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子KLF2在損傷主動(dòng)脈內(nèi)膜增生組織中的表達(dá)及變化，并以腺病毒為載體將KLF2轉(zhuǎn)染至血管平滑肌細(xì)胞，觀察其對(duì)血管平滑肌細(xì)胞增殖和遷移的影響。
　　方法:
　　1.雄性SD大鼠80只，隨機(jī)均分為8組，每組10只，其中7組為球囊損傷法建立主動(dòng)脈損傷模型組（損傷組）;1組為接受假手術(shù)組（對(duì)照組），僅行開(kāi)腹手術(shù)。分別在術(shù)后12小時(shí)

2、、1天、3天、1周、2周、4周、8周取材;測(cè)量?jī)?nèi)膜面積和中膜面積并計(jì)算內(nèi)膜面積/中膜面積，評(píng)估主動(dòng)脈損傷后內(nèi)膜增生程度;免疫組織化學(xué)法檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子KLF2蛋白水平的表達(dá)，IPP6.0軟件測(cè)定陽(yáng)性染色平均光密度作為評(píng)價(jià)指標(biāo)。
　　2.通過(guò)RT-PCR檢測(cè)損傷主動(dòng)脈內(nèi)膜增生組織中轉(zhuǎn)錄因子KLF2在mRNA水平的表達(dá)及其變化。以GAPDH表達(dá)作為內(nèi)參，KLF2/GAPDH作為轉(zhuǎn)錄因子KLF2的相對(duì)表達(dá)量。
　　3.頸離斷法處死SD

3、大鼠，每次取材5只，采用組織塊貼壁法原代培養(yǎng)大鼠主動(dòng)脈VSMCs并純化鑒定，攜帶轉(zhuǎn)錄因子KLF2的腺病毒載體以最佳感染復(fù)數(shù)體外轉(zhuǎn)染VSMCs。通過(guò)CCK-8和趨化小室檢測(cè)方法觀察KLF2轉(zhuǎn)染的VSMCs細(xì)胞增殖和遷移能力的變化。
　　結(jié)果:
　　1.主動(dòng)脈球囊損傷后1周可見(jiàn)明顯新生內(nèi)膜形成，不同時(shí)間點(diǎn)內(nèi)膜增生程度以IA/MA表示，主動(dòng)脈損傷后1周時(shí)IA/MA為0.175±0.048，損傷后2周時(shí)IA/MA為0.384±0.1

4、19，損傷后4周時(shí)IA/MA為0.558±0.213，損傷后8周時(shí)IA/MA為0.409±0.177。不難發(fā)現(xiàn)，主動(dòng)脈損傷后1周時(shí)出現(xiàn)增生內(nèi)膜組織，4周時(shí)內(nèi)膜增生最明顯，此后呈消退趨勢(shì)。損傷后2周、4周、8周時(shí)內(nèi)膜增生度比1周時(shí)明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);4周時(shí)內(nèi)膜增生度與2周、8周時(shí)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　2.免疫組化染色檢測(cè)主動(dòng)脈損傷血管組織，可見(jiàn)轉(zhuǎn)錄因子KLF2在損傷動(dòng)脈增生內(nèi)膜組織有陽(yáng)性表

5、達(dá)。通過(guò)IPP6.0測(cè)定中膜和內(nèi)膜陽(yáng)性染色平均光密度，損傷后1周時(shí)，中膜IOD/AA為0.072±0.022，內(nèi)膜IOD/AA為0.421±0.015，損傷后2周時(shí)，中膜IOD/AA為0.079±0.029，內(nèi)膜IOD/AA為0.788±0.040，損傷后4周時(shí)，中膜IOD/AA為0.069±0.018，內(nèi)膜IOD/AA為1.115±0.019，損傷后8周時(shí)，中膜IOD/AA為0.061±0.031，內(nèi)膜IOD/AA為0.708±0.0

6、36?？梢?jiàn)損傷后4周時(shí)內(nèi)膜增生組織中KLF2陽(yáng)性表達(dá)最強(qiáng)，此后KLF2陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)度逐漸減退。內(nèi)膜增生度變化曲線和增生內(nèi)膜中KLF2陽(yáng)性表達(dá)曲線隨時(shí)間變化呈現(xiàn)相似變化趨勢(shì)。
　　3.RT-PCR結(jié)果:對(duì)照組中KLF2/GAPDH為0.6894±0.04689，可見(jiàn)KLF2基礎(chǔ)水平表達(dá)，損傷后1周時(shí)KLF2/GAPDH為2.5112±0.2655，顯示高于基礎(chǔ)水平表達(dá)，損傷后4周時(shí)KLF2/GAPDH為12.8550±0.5465，顯

7、示表達(dá)達(dá)高峰，此后表達(dá)呈降低趨勢(shì)，損傷后8周時(shí)KLF2/GAPDH為3.0565±0.2565，但表達(dá)仍高于基礎(chǔ)水平。KLF2在損傷后1周、2周、4周、8周時(shí)內(nèi)膜增生組織中的KLF2/GAPDH與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)。內(nèi)膜增生度與KLF2相對(duì)表達(dá)量?jī)烧咧g具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的相關(guān)（r=0.70，P=0.001）。
　　4.采用組織塊貼壁法原代培養(yǎng)大鼠VSMCs生長(zhǎng)良好，4～8代時(shí)VSMCs純度大于90％。Ad

8、5-KLF2轉(zhuǎn)染VSMCs后檢測(cè)KLF2細(xì)胞免疫化學(xué)表達(dá)，表達(dá)率隨轉(zhuǎn)染時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增加，高水平的表達(dá)可持續(xù)14d以上。腺病毒Ad5-KLF2轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的大鼠VSMCs，可使KLF2在VSMCs中高效表達(dá)，并具有生物學(xué)活性。轉(zhuǎn)染后VSMCs可顯著促進(jìn)其增殖和遷移。
　　結(jié)論:
　　大鼠主動(dòng)脈球囊損傷動(dòng)物模型中，主動(dòng)脈損傷后1周時(shí)出現(xiàn)內(nèi)膜增生組織，4周時(shí)內(nèi)膜增生最明顯，此后呈消退趨勢(shì);轉(zhuǎn)錄因子KLF2在主動(dòng)脈內(nèi)膜增生組織中表達(dá)陽(yáng)性