KLF2調(diào)控Nrf2-Bach1在CSE誘導的大鼠氣道上皮細胞氧化與抗氧化機制中的作用.pdf

1、目的：研究Klf2及Nrf2/Bach1在經(jīng)CSE刺激的大鼠氣道上皮細胞中的表達，明確其感受氧化應激對靶基因γ-GCS的調(diào)控作用；探討CSE對氣道上皮細胞凋亡的影響，及其與氧化抗氧化反應之間的關(guān)系；觀察 KLF2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞后分別對Nrf2、Bach1和γ-GCS表達水平的影響。
　　方法：實驗分為兩部分。⑴不轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的細胞部分：采用酶消化法提取大鼠原代氣管-支氣管上皮細胞，噻唑藍（MTT）比色法測定10％香煙煙霧提取物（ciga

2、rette smoke extract，CSE）在不同時間點作用于細胞后對細胞增殖的影響；選取6小時時間點用Hoechst染色觀察細胞形態(tài)變化；并檢測該時間點細胞活性氧ROS含量；用雙酶法檢測γ-GCS活性；通過免疫細胞化學法觀察Nrf2/Bach1的核轉(zhuǎn)位；Western blot、RT-PCR技術(shù)研究細胞中Klf2、Nrf2、Bach1、γ-GCS的蛋白及mRNA表達。⑵轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的細胞部分：給予Klf2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞使之基因過表達，用

3、Western blot、RT-PCR法觀察細胞中Klf2、Nrf2、Bach1、γ-GCS的蛋白及mRNA表達變化。
　　結(jié)果：①CSE對細胞增殖的抑制呈時間依賴性（P＜0.05）；Hoechst染色和電鏡觀察結(jié)果為核染色質(zhì)的濃縮和邊集,甚至于核碎裂；②CSE組細胞中ROS含量、γ-GCS活性均較正常組細胞顯著升高（P＜0.01）；③免疫細胞化學結(jié)果顯示Nrf2經(jīng)CSE刺激后出現(xiàn)由核外向核內(nèi)的轉(zhuǎn)位，相反的Bach1經(jīng)CSE刺激后

4、出現(xiàn)由核內(nèi)向核外的轉(zhuǎn)位（P<0.05）；④Western blot結(jié)果顯示CSE處理組中Klf2、Nrf2、Bach1、γ-GCS蛋白水平較對照組升高（P<0.05）；⑤RT-PCR顯示CSE組中Klf2、Nrf2、Bach1、γ-GCS mRNA水平較對照組升高（P<0.05）；⑥Klf2過表達質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染細胞后，大鼠氣道上皮細胞中 Nrf2及γ-GCSmRNA、蛋白質(zhì)表達水平均顯著高于轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒組（P<0.01）；而Bach1mR

5、NA表達水平明顯低于空白質(zhì)粒組（P<0.05），其蛋白表達與空白質(zhì)粒組無明顯差別（P>0.05）；⑦經(jīng)10%CSE處理6h的空白質(zhì)粒組中Nrf2、γ-GCSmRNA與蛋白質(zhì)水平均明顯高于未經(jīng)處理的空白質(zhì)粒組（P<0.05）；Bach1mRNA水平明顯低于未經(jīng)處理的空白質(zhì)粒組（P<0.05），其蛋白水平與對照組無明顯差別（P>0.05）；⑧經(jīng)10%CSE處理6h的Klf2質(zhì)粒組中Nrf2、γ-GCSmRNA與蛋白質(zhì)水平均明顯高于未經(jīng)處理的

6、Klf2質(zhì)粒組（P<0.05）；Bach1mRNA與蛋白質(zhì)水平明顯低于未經(jīng)處理的Klf2質(zhì)粒組（P<0.05）；⑨經(jīng)10%CSE處理6h的Klf2質(zhì)粒組中Nrf2、γ-GCSmRNA與蛋白質(zhì)水平均明顯高于經(jīng)10%CSE處理6h的空白質(zhì)粒組（P<0.05）；Bach1mRNA與蛋白質(zhì)水平明顯低于經(jīng)10%CSE處理6h的空白質(zhì)粒組（P<0.05）。
　　結(jié)論：⑴CSE誘導細胞發(fā)生氧化應激反應，使胞內(nèi)ROS含量上升，最終效應是誘導細胞的