KLF4在內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)及其對(duì)vWF、PAI-1的影響.pdf

1、血管內(nèi)皮細(xì)胞是構(gòu)成血管壁的主要細(xì)胞成分，不僅參與創(chuàng)傷、休克、感染、心血管疾病、腫瘤等多種疾病的發(fā)生、發(fā)展，而且在血管通透性屏障、免疫防御及炎癥反應(yīng)中起著極為重要的作用。生理?xiàng)l件下，血管內(nèi)皮細(xì)胞通過(guò)釋放內(nèi)皮衍生松弛因子(EDRF)、血栓調(diào)節(jié)蛋白(TM)和組織型纖溶酶原激活物(t-PA)等各種活性物質(zhì)，抑制血小板聚集、血液凝固以及促進(jìn)纖溶，防止血栓形成，從而維持血流通暢；在IL-1β、LPS、TNF—α等炎性因子的刺激下，血管內(nèi)皮細(xì)胞則可受

2、損，內(nèi)皮細(xì)胞釋放的促栓物質(zhì)和抑栓物質(zhì)失衡，抗血栓能力減弱，促進(jìn)血栓形成。 人KLF4基因定位于9q31，其蛋白質(zhì)由470個(gè)氨基酸構(gòu)成。KLF4在體內(nèi)分布廣泛，參與細(xì)胞凋亡、增殖、分化以及腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，其調(diào)節(jié)機(jī)制可能與乙?；揎椨嘘P(guān)。1998年，Yet等證實(shí)KLF4在人主動(dòng)脈和臍靜脈的內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)，影響內(nèi)皮細(xì)胞炎性調(diào)節(jié)因子的釋放，具有抗炎作用。 因此，明確KLF4在炎性因子刺激內(nèi)皮細(xì)胞中的作用，探索KLF4在內(nèi)皮細(xì)胞

3、血栓調(diào)節(jié)中的作用和可能機(jī)制，對(duì)闡明炎性因子誘導(dǎo)血栓形成的機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 目的: 本課題擬通過(guò)體外培養(yǎng)人原代臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，IL-1β和TNF—α為炎性刺激因子，觀察KLF4、vWF、PAI-1在內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)變化。采用同源重組方法構(gòu)建攜帶反義KLF4基因腺病毒，觀察干擾內(nèi)皮細(xì)胞中KLF4表達(dá)后，對(duì)炎性因子誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞中vWF、PAI-1的影響，明確KLF4對(duì)血栓形成關(guān)鍵物質(zhì)vWF、PAI-1基因表達(dá)的調(diào)節(jié)，闡明KLF4在

4、內(nèi)皮細(xì)胞血栓調(diào)節(jié)中的作用，并初步探討KLF4影響內(nèi)皮細(xì)胞抗栓作用的具體作用機(jī)制。 方法: 采用胰蛋白酶消化法，從新鮮臍靜脈分離和培養(yǎng)原代人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)，通過(guò)形態(tài)學(xué)和流式細(xì)胞儀方法進(jìn)行鑒定。炎性刺激因子IL-1β(2.5ng/mL)、TNF—α(10ng/mL)分別刺激HUVECs2h、4h后，以正常HUVECs為對(duì)照，提取細(xì)胞RNA和蛋白。采用Real—timePCR、Westernblot、激光共聚焦顯微鏡技

5、術(shù)觀察臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中KLF4、PAI-1和vWFmRNA、蛋白的表達(dá)。 通過(guò)同源重組方法構(gòu)建Ad—反義KLF4腺病毒。將KLF4基因片段反向克隆到重組腺病毒載體Ad—Easy系統(tǒng)中的穿梭質(zhì)粒pshuttle—CMV的多克隆位點(diǎn)(multiple cloning site，MCS)，構(gòu)建出攜帶反義KLF4基因片段的重組穿梭質(zhì)粒pshuttle—CMV—反義KLF4；再將pshuttle—CMV—反義KLF4與重組腺病毒載體Ad—

6、Easy系統(tǒng)中的骨架質(zhì)粒pAdEasy-1在大腸桿菌BJ5183內(nèi)進(jìn)行同源重組。酶切線性化重組載體并轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，經(jīng)293細(xì)胞包裝生成攜帶反義KLF4基因片段的重組腺病毒Ad—反義KLF4。將重組腺病毒Ad—反義KLF4按照不同濃度感染人原代臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，確定最佳感染率。采用Real—timePCR、Western blot方法觀察重組腺病毒Ad—反義KLF4對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞中KLF4表達(dá)的抑制效果。 重組腺病毒Ad—反義KLF4

7、感染內(nèi)皮細(xì)胞48h后，IL-1β刺激4h，提收取細(xì)胞RNA和蛋白。同時(shí)，采用Ad—GFP病毒作為對(duì)照。Real—timePCR檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞中KLF4、PAI-1、vWFmRNA表達(dá)；Western blot檢測(cè)KLF4、PAI-1蛋白的表達(dá)；激光共聚焦顯微鏡觀察KLF4、vWF表達(dá)和定位。免疫共沉淀技術(shù)觀察KLF4乙酰化水平變化。觀察抑制KLF4表達(dá)對(duì)炎性因子刺激內(nèi)皮細(xì)胞中PAI-1和vWF表達(dá)的影響，以及可能的作用機(jī)制。各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以

8、均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示。兩組數(shù)據(jù)間的差異用方差分析。P＜0.05為差異有顯著性。 結(jié)果: 1．選用新鮮臍帶作為血管內(nèi)皮細(xì)胞的來(lái)源，采用0.25％胰蛋白酶消化法分離原代臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)，通過(guò)形態(tài)學(xué)和細(xì)胞表面特異性標(biāo)記的方法進(jìn)行鑒定，倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞呈梭狀或鵝卵石樣鑲嵌排列，單層生長(zhǎng)，胞漿豐富，胞核可見(jiàn)，為圓形或橢圓形；流式細(xì)胞儀觀察到大部分細(xì)胞均可表達(dá)vWF抗原和CD31抗原，證實(shí)所分離和培養(yǎng)的細(xì)

9、胞為HUVEC。 2．KLF4在正常臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)，定位于細(xì)胞核中。炎性因子增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞中KLF4的表達(dá)。隨著刺激時(shí)間的延長(zhǎng)，KLF4表達(dá)逐漸增強(qiáng)。明顯高于正常HUVECs中KLF4表達(dá)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。 3．IL-1β、TNF—α刺激內(nèi)皮細(xì)胞中vWF、PAI-1表達(dá)，與正常HUVECs中vWF、PAI-1表達(dá)比較，差異具有顯著性(P＜0.05)。炎性因子刺激4h組中vWF、PAI-1表達(dá)高于其

10、在2h組中表達(dá)(P＜0.05)。其中以IL-1β刺激組中vWF、PAI-1表達(dá)增加明顯，均高于TNF—α刺激組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。 4．成功地構(gòu)建出攜帶反義KLF4基因片段的重組腺病毒Ad—反義KLF4，經(jīng)菌液PCR、酶切和DNA測(cè)序鑒定重組腺病毒完全正確，并在HEK293A細(xì)胞中包裝、擴(kuò)增腺病毒，獲得高濃度Ad—反義KLF4腺病毒。 5．熒光顯微鏡下觀察，以MOI值200的Ad—GFP感染HUVECs

11、48h后，近90％內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)綠色熒光。故選擇MOI值200的Ad—反義KLF4腺病毒感染HUVECs細(xì)胞，觀察KLF4對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞中vWF、PAI-1的調(diào)節(jié)。 6．MOI值200的重組腺病毒Ad—反義KLF4感染HUVECs后可使KLF4表達(dá)明顯下降(0.44±0.06)，與Ad—GFP組(0.61±0.01)和未感染組(0.59±0.01)比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。而Ad—GFP組與未感染組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

12、(P＞0.05)。 7．Ad—反義KLF4感染HUVECs后，vWF、PAI-1表達(dá)隨之明顯增加(1.17±0.05，0.73±0.01)，與感染Ad—GFP組(1.04±0.03，0.67±0.04)相比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。IL-1β刺激Ad—反義KLF4感染HUVECs組，vWF、PAI-1表達(dá)增加顯著(1.90±0.11，0.97±0.02)，明顯高于單純炎性刺激組(1.22±0.06，0.86±0.0

13、4)(P＜0.05)。 8．炎性因子IL-1β刺激內(nèi)皮細(xì)胞KLF4乙?；皆黾?。 結(jié)論: 1．炎性因子增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞中KLF4表達(dá)。 2．IL-1β、TNF—α刺激內(nèi)皮細(xì)胞vWF、PAI-1表達(dá)。 3．抑制KLF4表達(dá)后，炎性因子誘導(dǎo)vWF、PAI-1表達(dá)增強(qiáng)，內(nèi)皮細(xì)胞的促栓作用增強(qiáng)。 4．KLF4具有抑栓作用，KLF4乙?；赡苁瞧錂C(jī)制之一。 5．KLF4可能是內(nèi)皮細(xì)胞抗栓作用的