壁虎多肽混合物A抗血管生成作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：觀察壁虎多肽混合物 A（GPMA）抗腫瘤血管生成的作用,并探討其機(jī)制。
　　方法：⑴建立雞胚尿囊膜血管形成模型（CAM模型），采用一日齡受精種蛋50只溫箱孵育到九日齡，隨機(jī)分為5組，每組10只，分別為實(shí)驗(yàn)組（高、中、低壁虎多肽混合物）、陰性對照組和陽性對照組。在蛋殼上開窗暴露雞胚尿囊膜，將提前制備好的甲基纖維素薄片放置于尿囊膜新生毛細(xì)血管區(qū)域，作為藥物載體。然后給予實(shí)驗(yàn)組雞胚不同濃度壁虎多肽。觀察壁虎多肽對雞胚尿囊膜新生血管

2、的抑制作用；陰性對照組給予等量生理鹽水，陽性對照組用5-氟尿嘧啶，48h后觀察甲基纖維素薄片覆蓋區(qū)及周圍血管生成情況；⑵分離、培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC），用倒置顯微鏡觀察體外培養(yǎng) HUVEC的形態(tài)變化，并用MTT比色法測定含不同濃度（0.4mg/mL、0.2mg/mL、0.1mg/mL、0.05mg/mL、0.025mg/mL）的壁虎多肽混合物 A對HUVEC增殖的影響；⑶培養(yǎng)人EC109腫瘤細(xì)胞，用免疫組化法觀察0.2mg/m

3、L和0.1mg/mL壁虎多肽混合物 A作用24h后對 EC109細(xì)胞 VEGF蛋白表達(dá)的影響；⑷建立小鼠H22移植腫瘤模型，用免疫組化法和 Western-blot法檢測小鼠 H22移植腫瘤組織對VEGF蛋白表達(dá)的影響。
　　結(jié)果：①陰性對照組的大血管數(shù)量、血管密度、血管分支明顯多于壁虎多肽組，管徑也較壁虎多肽組粗，加入壁虎多肽高劑量組的CAM上只見極少數(shù)管徑極細(xì)的大血管，血管分支明顯減少，細(xì)小血管幾乎不見，甚至出現(xiàn)溶血現(xiàn)象。壁虎

4、多肽在40μg/egg時抑制率為90％，與對照組比差異有顯著性。解剖顯微鏡下觀察并計數(shù)全視野內(nèi)的大小血管，用藥組血管總數(shù)明顯減少。②倒置顯微鏡下可見，正常人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞貼壁單層生長，鋪路石狀單層梭形細(xì)胞排列，細(xì)胞為扁平多角形，邊界清楚，胞漿豐富、胞核清晰可見，為圓形或橢圓形。加藥24小時后，各藥物組細(xì)胞排列紊亂，尤其5-FU陽性藥物及大劑量藥物組作用明顯、細(xì)胞數(shù)量明顯減少。MTT結(jié)果顯示藥物對其抑制作用隨濃度、時間的增加而加強(qiáng)。③在體

5、外 EC109腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，免疫組化結(jié)果顯示壁虎多肽混合物A在0.2mg/mL、0.1mg/mL劑量下均能明顯降低EC109腫瘤細(xì)胞的VEGF的表達(dá)。④在小鼠 H22移植腫瘤模型，腹腔注射高（80mg/kg）、中（40mg/kg）、低（20mg/kg）劑量壁虎多肽混合物A，免疫組化和Western-blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示壁虎多肽混合物A能抑制腫瘤組織中VEGF蛋白的產(chǎn)生。
　　結(jié)論：壁虎多肽混合物A可以抑制正常及腫瘤組織的血管