散結(jié)抗瘤方對(duì)S180荷瘤小鼠抑瘤作用和抗血管生成的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景：
　　 21世紀(jì)初,惡性腫瘤仍是危害人類健康最嚴(yán)重的一類疾病。在人類死亡病因中,癌癥位居第一,并且其發(fā)病率仍在上升。據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)報(bào)道,全世界每年約有1000萬人死于惡性腫瘤,不僅惡性腫瘤的發(fā)病率在上升,而且在發(fā)病年齡上日趨年輕化。如何有效的預(yù)防和治療癌癥,成為醫(yī)學(xué)界關(guān)注的重要課題之一。
　　 抗腫瘤藥物的研究一直是醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn),藥物的作用機(jī)制主要包括:1、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡；2、細(xì)胞毒作用；3、抑制

2、腫瘤細(xì)胞的增殖；4、抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移等。自從八十年代初Folkman提出腫瘤生長依賴新血管生成的理論,阻斷腫瘤血管生成、切斷腫瘤組織獲得營養(yǎng)途徑已經(jīng)成為新的抗腫瘤治療靶點(diǎn),而且也成為抗腫瘤治療中熱門的研究內(nèi)容。目前已證實(shí)的血管生成調(diào)控因子,可分為血管生成因子和血管生成抑制因子兩類。而血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)作為一種誘導(dǎo)血管形成的血管生長因子,在血管生成過程

3、中起核心作用。
　　 在惡性腫瘤的病理中,細(xì)胞對(duì)低氧的適應(yīng)和血管生成是腫瘤發(fā)展過程中的關(guān)鍵步驟之一。缺氧誘導(dǎo)因子-1a(hypoxia inducible factor-1a,HIF-1a)是廣泛存在于哺乳動(dòng)物和人體內(nèi)的一種轉(zhuǎn)錄因子,是主要的氧調(diào)節(jié)亞基和功能亞基,在腫瘤的氧反應(yīng)過程中HIF-1a起著中樞紐帶的作用。促血管生成因子中最重要的是VEGF,能增加血管的通透性,促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的遷移、增生和腫瘤新生血管的生成,促進(jìn)腫瘤的生長

4、和侵襲、轉(zhuǎn)移。國內(nèi)外研究表明,VEGF通過旁分泌和自分泌機(jī)制從而促血管生成、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長侵潤和轉(zhuǎn)移,其在大多數(shù)腫瘤細(xì)胞內(nèi)呈高表達(dá)。已有的研究表明,隨著腫瘤體積的不斷快速增大,腫瘤便進(jìn)入了缺氧狀態(tài),從而使大量HIF-1a積聚。增多的HIF-1a就會(huì)與其下游攜帶有低氧反應(yīng)元件(HRE)特異區(qū)域的靶基因結(jié)合使其表達(dá)增強(qiáng),其中VEGF就是其靶基因中最重要的一種因子。因此,對(duì)于“HIF-VEGF-血管生成”途徑的研究,具有十分重要的意義。

5、r>　　 在祖國醫(yī)學(xué)理論中,癌病是多種惡性腫瘤的總稱。癌病的發(fā)生是在臟腑陰陽氣血失調(diào)的基礎(chǔ)上,六淫邪毒入侵,并與氣、痰、濕、瘀、熱等搏結(jié)積聚而成。中藥治療腫瘤有多種不同的治則。行氣化痰、活血化瘀、清熱解毒、補(bǔ)益氣血、利水滲濕等類中藥均具有不同程度的抑癌作用。而今隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展及中醫(yī)現(xiàn)代化的進(jìn)展,中藥單體和復(fù)方在抗腫瘤血管生成的實(shí)驗(yàn)研究中取得了長足的進(jìn)展,如姜黃、川芎、全蝎、壁虎、鱉甲煎丸、參麥注射液、當(dāng)歸補(bǔ)血湯等均已證明具有

6、很好的抑制血管生長的作用。散結(jié)抗瘤方是導(dǎo)師陳達(dá)理教授根據(jù)多年的臨床實(shí)踐,總結(jié)出來的中藥抗癌復(fù)方,我們臨床上觀察到它對(duì)各種實(shí)體瘤具有良好的療效,且先前的實(shí)驗(yàn)研究已經(jīng)證明:該方抑瘤作用可能與其誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。散結(jié)抗瘤方以消癮化積、軟堅(jiān)散結(jié)、以毒攻毒為主要功效,由浙貝、法夏、蜈蚣、夏枯草、白花蛇舌草等8味藥組成。關(guān)于這類藥的抗腫瘤作用已有很多文獻(xiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以S180移植性肉瘤小鼠為研究對(duì)象,觀察該復(fù)方對(duì)VEGF和HIF-1a表達(dá)的

7、調(diào)控,探求該方抑制腫瘤血管生成的可能作用靶點(diǎn)。
　　 在中醫(yī)藥抗腫瘤的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究中,建立惡性腫瘤動(dòng)物模型一般來說分為三種:自發(fā)腫瘤模型、誘發(fā)腫瘤模型和移植腫瘤模型。移植腫瘤模型是目前研究最多的腫瘤模型,容易人為操作,動(dòng)物成瘤穩(wěn)定,均一性好,發(fā)病率高,成瘤時(shí)間差異不大,容易施加干擾因素等。該模型不能用于病因?qū)W、癌前病變和癌變的研究,但對(duì)成瘤、治療、浸潤和轉(zhuǎn)移等研究非常有用。本實(shí)驗(yàn)選用S180可移植性腫瘤細(xì)胞株,成功造成移植腫瘤模

8、型。目前此模型已廣泛的應(yīng)用于腫瘤基礎(chǔ)研究及藥物篩選,成為研究中醫(yī)藥抗腫瘤的作用及機(jī)制的一個(gè)公認(rèn)的腫瘤模型。
　　 研究目的：
　　 觀察散結(jié)抗瘤方對(duì)S180荷瘤小鼠的抑瘤作用及對(duì)免疫器官的影響,并通過免疫組化方法檢測VEGF、HIF-1a的表達(dá),來探討其抗血管生成作用的機(jī)制,為臨床應(yīng)用提供基礎(chǔ)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 研究方法
　　 建立小鼠移植S180肉瘤模型:體外復(fù)蘇培養(yǎng)S180細(xì)胞,在細(xì)胞的指數(shù)生長期收集

9、細(xì)胞,用無菌生理鹽水稀釋,調(diào)整到2～3×106/ml。隨機(jī)選取10只健康SPF級(jí)昆明小鼠,每只用上述細(xì)胞懸液0.4ml腹腔注射,約1周后接種小鼠腹部明顯漲大、凸出,將小鼠頸椎脫臼處死,超凈臺(tái)內(nèi)無菌抽取乳白色腹水液,用生理鹽水稀釋,調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1～2×107/ml,取0.2ml于每只小鼠右上肢腋窩消毒后皮下接種。瘤細(xì)胞懸液接種前,均用0.2％臺(tái)盼藍(lán)染色,計(jì)算活細(xì)胞數(shù)為95％～98％。從抽取腹水開始,到接種完最后1只小鼠的總時(shí)間控制在1h內(nèi)

10、。
　　 隨機(jī)將接種后的小鼠分為荷瘤對(duì)照組、環(huán)磷酰胺(CTX)組、散結(jié)抗瘤方組、散結(jié)抗瘤方加CTX組(聯(lián)合組)。每組10只。荷瘤對(duì)照組給予蒸餾水0.5ml灌胃,生理鹽水0.2ml腹腔注射；環(huán)磷酰胺組給予蒸餾水0.5ml灌胃,環(huán)磷酰胺20 mg/kg腹腔注射；散結(jié)抗瘤方組(根據(jù)人與小鼠藥物劑量換算公式計(jì)算)相應(yīng)劑量灌胃,生理鹽水0.2ml腹腔注射；散結(jié)抗瘤方加CTX組(聯(lián)合組)散結(jié)方藥液相應(yīng)劑量灌胃,環(huán)磷酰胺20mg/kg腹腔注射

11、。實(shí)驗(yàn)過程中每3天稱1次體重,根據(jù)體重計(jì)算相應(yīng)的給藥量。用藥后注意觀察動(dòng)物的一般情況。各組連續(xù)給藥15天。停藥次日稱重并處死小鼠,解剖剝離瘤塊,稱重計(jì)算均值,計(jì)算腫瘤抑制率；同時(shí)取出小鼠的脾臟和胸腺,稱其重量,計(jì)算脾臟、胸腺指數(shù)。腫瘤組織用10％中性甲醛固定,梯度酒精脫水,二甲苯透明,石蠟包埋切片,HE染色,光鏡觀察腫瘤組織的病理改變。采用免疫組化SP法檢測各組荷瘤小鼠腫瘤組織的VEGF、HIF-1a的表達(dá)強(qiáng)度。
　　 研究結(jié)果

12、
　　 1、荷瘤對(duì)照組腫瘤生長較快,并且小鼠飲食減少,毛發(fā)雜亂無光澤,豎毛現(xiàn)象明顯；其他各組腫瘤生長相對(duì)緩慢,散結(jié)抗瘤方組和聯(lián)合組小鼠明顯比荷瘤對(duì)照小鼠活潑,皮毛有光澤,豎毛現(xiàn)象不明顯；環(huán)磷酰胺組小鼠狀況最差。
　　 2、散結(jié)抗瘤方、環(huán)磷酰胺組、聯(lián)合組的瘤重與荷瘤對(duì)照組相比差異顯著(F=52.692,P=0.000)；且聯(lián)合組的瘤重明顯低于散結(jié)抗瘤方組和環(huán)磷酰胺組(P<0.05)。單獨(dú)應(yīng)用散結(jié)抗瘤方和環(huán)磷酰胺的抑瘤率分別

13、為30.26％和51.55％,而在相同條件下,聯(lián)合用藥組抑瘤率為71.14％,按照金氏公式求的q值為1.08,表明兩藥聯(lián)合應(yīng)用具有協(xié)同作用。
　　 3、散結(jié)抗瘤方組的胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)較荷瘤對(duì)照組和環(huán)磷酰胺組有顯著性提高,差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與環(huán)磷酰胺組比較,聯(lián)合組的胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)均有顯著性提高(P<0.05)。
　　 4、HE染色切片可見:荷瘤對(duì)照組腫瘤細(xì)胞排列較密集,瘤組織內(nèi)小血管較豐富。各給藥組

14、均可見不同程度的片狀壞死區(qū),瘤組織及其周圍新生微血管減少,其中以聯(lián)合組最為顯著。
　　 5、各組小鼠腫瘤組織中VEGF和HIF-1a蛋白的表達(dá):與荷瘤對(duì)照組比較,其余實(shí)驗(yàn)各組的VEGF、HIF-1a蛋白的表達(dá)均明顯降低(F=54.982,P=0.000；F=88.759,P=0.000)。與散結(jié)抗瘤方組比較,環(huán)磷酰胺組的VEGF和HIF-1a的表達(dá)顯著降低(P<0.05)。
　　 6、HIF-1a與VEGF表達(dá)的相關(guān)性:

15、Spearman等級(jí)相關(guān)分析結(jié)果顯示,HIF-1a的表達(dá)與VEGF表達(dá)之間呈正相關(guān)(r=0.806,P=0.000)。
　　 研究結(jié)論
　　 散結(jié)抗瘤方可以改善荷瘤小鼠的生存狀態(tài)；同時(shí)可以抑制腫瘤生長,且與CTX有協(xié)同作用。散結(jié)抗瘤方有減除腫瘤對(duì)宿主免疫器官的損害和抑制作用,且可提高宿主的免疫功能。散結(jié)抗瘤方可以抑制小鼠腫瘤組織的VEGF、HIF-1a的表達(dá),且HIF-1a和VEGF之間正相關(guān),由此提示HIF-1a可能參