MTX和HCQ對PGI2類似物調(diào)節(jié)Treg-Th1-7細胞分化的影響.pdf

1、CD4+T細胞是適應(yīng)性免疫應(yīng)答系統(tǒng)的主要組分，在調(diào)節(jié)抗原特異性免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用。一旦被活化之后，初始CD4+T細胞(naiveCD4+T cell)可分化成具有不同功能的各種T細胞亞群，包括Th1(T helpcell1)，Th2(T help cell2)，Th17（IL-17 producing T cell）細胞和調(diào)節(jié)性T細胞(regulatory T cell，Treg)，目前廣泛認為Th17和Treg細胞的分化平衡在類風(fēng)

2、濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）等自身免疫病的發(fā)生發(fā)展中起更重要的作用。Th17細胞因其可分泌IL-17（interleukin17）而命名，表達特異性轉(zhuǎn)錄因子RORC（orphan nuclear receptor C），具有促炎癥反應(yīng)的作用，且與組織特異性自身免疫性疾病的免疫應(yīng)答相關(guān)。Treg細胞表達CD25和FoxP3(foxhead box protein3)，具有抑制T細胞增殖、抑制抗原呈遞細胞(an

3、tigen presenting cell，APC)的功能、抑制促炎性細胞因子及抗體的分泌等作用，在抑制移植物耐受、阻止自身免疫反應(yīng)和維持機體免疫平衡穩(wěn)態(tài)等方面發(fā)揮重要功能?？乖岢蔬^程中，T細胞的分化方向主要決取于三個因素:T細胞抗原受體(T cells receptor, TCR)的刺激強度、細胞因子的種類和APCs所分泌的其他調(diào)節(jié)介質(zhì)，如前列腺素(prostaglandin，PGs)。
　　PGs包括PGD2，PGE2，PG

4、F2，PGI2和TXA2，對免疫系統(tǒng)有明確的調(diào)節(jié)作用，一直以來PGE2被認為是引起RA的首要PG。但目前的研究結(jié)果顯示，在膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎(collagen induced arthritis，CIA)小鼠的疾病進展中，PGI2和PGE2發(fā)揮同等重要的作用。已有包括我室在內(nèi)的一些研究致力于PGE2對Treg和Th17細胞分化的調(diào)節(jié)作用，結(jié)果顯示PGE2可通過調(diào)節(jié)Treg/Th17細胞平衡參與RA發(fā)病。但是，關(guān)于PGI2調(diào)節(jié)Treg和Th

5、17分化的作用尚不明確。
　　PGI2通過結(jié)合G蛋白偶聯(lián)受體IP發(fā)揮其生物學(xué)作用，IP受體活化可引起胞內(nèi)環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)水平升高及下游蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)活化。另外，轉(zhuǎn)錄活化子5（signal transducers and transcription activators5，STAT5）和轉(zhuǎn)錄活化子3（STAT3）分別是調(diào)節(jié)T細

6、胞向Treg和Th17細胞分化的關(guān)鍵核轉(zhuǎn)錄因子。有趣的是，STAT5活化可促進Treg細胞而抑制Th17分化，而STAT3磷酸化可促進RORC而抑制FoxP3表達。而且，cAMP-PKA信號通路的活化有可能導(dǎo)致STAT3和STAT5磷酸化水平的變化。然而，cAMP-PKA信號通路是否參與了PGI2調(diào)節(jié)Treg和Th17細胞分化的過程，以及PGI2對STAT3和STAT5的活化有無調(diào)節(jié)作用尚無文獻報道。
　　甲氨蝶呤(methotr

7、exate，MTX)和羥氯喹(hydroxychloroquine，HCQ)都是常用的慢作用抗風(fēng)濕藥（disease-modifying antirheumatic drug，DMARDs），二者單獨或聯(lián)合使用對RA有明顯療效，但其作用機制尚未完全闡明。研究結(jié)果表明MTX和HCQ治療RA的機制都有可能與Treg細胞有關(guān)，而Treg和Th17細胞在分化上相互抑制。如果PGI2確實可以影響Treg和Th17細胞分化，比如說導(dǎo)致二者分化失衡，

8、那么MTX和HCQ對PGI2的作用結(jié)果會有什么影響呢？
　　基于上述理論和研究結(jié)果，我們認為炎性介質(zhì)PGI2可能對Treg/Th17分化具有調(diào)控作用，進而參與RA的發(fā)病和進展，cAMP-PKA信號通路，STAT3和STAT5分子可能參與了該調(diào)節(jié)過程，而MTX和HCQ可能通過影響PGI2對Treg/Th17分化的調(diào)節(jié)作用而治療RA。據(jù)此，本課題使用磁珠分選健康人外周血來源的na(i)ve CD4+T細胞，分別體外誘導(dǎo)其向Treg和T

9、h17細胞分化，檢測PGI2類似物對Treg和Th17細胞分化的調(diào)節(jié)作用，并探索cAMP-PKA信號通路，STAT3和STAT5分子在其調(diào)節(jié)過程中的作用，同時觀察MTX和HCQ對PGI2所致的上述調(diào)節(jié)作用及相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響，以進一步探索PGI2在RA發(fā)病中的免疫調(diào)節(jié)機制及MTX和HCQ的治療機制。
　　1.PGI2類似物對Th0向Treg和Th17細胞分化的調(diào)節(jié)作用
　　目的:Treg和Th17細胞的分化平衡在RA等自

10、身免疫病的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，PGE2可通過調(diào)節(jié)Treg/Th17細胞平衡參與RA發(fā)病。在CIA小鼠的疾病進展中，PGI2和PGE2作用相似。故本部分研究使用磁珠分選健康人外周血來源的na(i)ve CD4+T細胞，體外分別誘導(dǎo)其向Treg和Th17細胞分化，檢測PGI2類似物對Th0細胞向Treg和Th17細胞分化的調(diào)節(jié)作用。
　　方法:免疫磁珠法分選健康人外周血來源的CD4+CD45RA+ T細胞，流式細胞術(shù)鑒定純度。(1)

11、首先檢測PGI2受體IP的表達:使用RT-PCR、流式細胞術(shù)和熒光免疫共聚焦技術(shù)檢測na(i)ve CD4+T表面是否有IP受體的表達。(2) Treg和Th17細胞誘導(dǎo)成功的鑒定:收集分選后的細胞，接種于anti-CD3預(yù)先包被的24孔板，加入anti-CD28、TGF-β1和IL-2誘導(dǎo)Th0向Treg分化;或加入anti-CD28、TGF-β1、IL-6、IL-1β和IL-23誘導(dǎo)Th0向Th17分化，誘導(dǎo)培養(yǎng)7天。分別于0d、1

12、d、3d、5d和7d收集細胞，RT-PCR檢測FoxP3或RORC mRNA的相對表達;在7d收集細胞，用流式細胞術(shù)測定CD25+FoxP3+T或CD4+IL-17+T的細胞數(shù)量，并用ELISA方法測定Th17細胞上清中IL-17A含量。(3) PGI2類似物(伊洛前列素，Iloprost)對Th0向Treg和Th17細胞分化的調(diào)節(jié)作用及其受體學(xué)機制:將收集的細胞各分為六組:Control組（單純誘導(dǎo)組）;Iloprost（0.1μM、

13、1μM、10μM）組;IP拮抗劑組(CAY10449);CAY10449+Iloprost（10μM）組，按照上述誘導(dǎo)方案分別培養(yǎng)7天，收集細胞，用RT-PCR檢測FoxP3或RORC mRNA的表達;流式細胞術(shù)測定CD25+FoxP3+T或CD4+IL-17+T的細胞數(shù)量;用ELISA方法測定Th17細胞上清中IL-17A含量。
　　結(jié)果:(1) RT-PCR結(jié)果顯示，人外周血來源的na(i)ve CD4+T表達一定水平的IP

14、mRNA，流式細胞術(shù)和免疫共聚焦的結(jié)果進一步證實了IP蛋白的表達。(2)誘導(dǎo)培養(yǎng)7d后，使得（30.83±5.77）％細胞同時表達CD25和FoxP3，CD4+IL-17+T細胞比例達到（5.39±0.88）％。RT-PCR結(jié)果顯示，F(xiàn)oxP3或RORC mRNA的表達均具時間依從性，且均在7d達到高峰，說明成功誘導(dǎo)了Treg和Th17細胞的分化。(3) Iloprost能劑量依賴性抑制FoxP3 mRNA的表達和CD25+FoxP3+

15、T細胞增殖(P＜0.05);同時，Iloprost可劑量依賴性增加RORC mRNA的表達水平和CD4+IL-17+T細胞的數(shù)量(P＜0.05)，另外，Iloprost也促進了IL-17A的分泌(P＜0.05)。(4)使用CAY10449拮抗IP受體之后，Iloprost的上述作用在很大程度上被阻斷。
　　以上結(jié)果提示，PGI2類似物通過與na(i)ve CD4+T細胞表面的IP受體結(jié)合而抑制Treg細胞分化，同時促進Th17細胞

16、分化。我室之前的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PGE2可通過調(diào)節(jié)Treg/Th17細胞平衡參與RA發(fā)病。綜合分析這些實驗結(jié)果，提示前列腺素通過調(diào)節(jié)Treg和Th17分化而導(dǎo)致Treg/Th17分化失衡，在諸如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等自身免疫性疾病的發(fā)病中發(fā)揮重要作用。
　　2.MTX和HCQ對PGI2類似物調(diào)節(jié)Treg/Th17細胞分化的影響
　　目的: MTX和HCQ都是常用的DMARDs，二者單獨或聯(lián)合使用對RA有明顯療效，但其作用機制尚未完全

17、闡明，研究表明MTX和HCQ的治療機制可能與Treg細胞有關(guān)。本部分研究體外誘導(dǎo)Th0向分別向Treg和Th17細胞分化，觀察單獨和聯(lián)合應(yīng)用MTX和HCQ對Treg和Th17細胞分化的調(diào)節(jié)作用，及其對Iloprost所引起的Treg/Th17分化失衡產(chǎn)生的影響，以期進一步揭示MTX和HCQ的免疫調(diào)節(jié)機制。
　　方法:CD4+CD45RA+ T細胞的分選同第一部分。(1) MTX和HCQ單獨及聯(lián)合作用對Treg和Th17細胞分化的影

18、響:將收集的細胞各分為八組:Control組（單純誘導(dǎo)組）;MTX(1nM、10nM、100nM)組;HCQ(1nM、10nM、100nM)組;MTX(100nM)+HCQ(100nM)組，按照上述Treg和Th17細胞誘導(dǎo)方案分別培養(yǎng)7天，收集細胞，用RT-PCR檢測FoxP3或RORC mRNA的表達;流式細胞術(shù)測定CD25+FoxP3+T或CD4+IL-17+T的細胞數(shù)量;用ELISA方法測定Th17分化細胞上清中IL-17A含量

19、。(2) MTX和HCQ單獨及聯(lián)合作用對Iloprost所引起的Treg/Th17分化失衡產(chǎn)生的影響:將收集的細胞各分為七組:Control組（單純誘導(dǎo)組）;Iloprost(10μM)組;MTX（100nM）組;HCQ（100nM）組;Iloprost+MTX組;Iloprost+HCQ組;Iloprost+MTX+HCQ組，按照上述Treg和Th17細胞誘導(dǎo)方案分別培養(yǎng)7天，收集細胞，用RT-PCR檢測FoxP3或RORC mRNA

20、的表達;流式細胞術(shù)測定CD25+FoxP3+T或CD4+IL-17+T的細胞數(shù)量;用ELISA方法測定Th17分化細胞上清中IL-17A含量。
　　結(jié)果:
　　(1)單獨HCQ和MTX+HCQ聯(lián)合作用均能增加FoxP3 mRNA的表達和CD25+FoxP3+T細胞的數(shù)量(P＜0.05)，且降低RORC mRNA的表達水平和CD4+IL-17+T細胞的數(shù)量（P＜0.05），HCQ的上述作用具劑量依賴性。另外，單獨HCQ和MTX

21、+HCQ聯(lián)合作用均抑制了IL-17A的分泌(P＜0.05)。而單獨MTX對上述指標均無明顯影響（P＞0.05）。單獨HCQ和MTX+HCQ聯(lián)合的作用效應(yīng)相比基本無顯著差異（P＞0.05）。
　　(2) MTX和HCQ單獨及聯(lián)合作用均可上調(diào)Iloprost所抑制的FoxP3 mRNA的表達和CD25+FoxP3+T細胞的數(shù)量(P＜0.05)，且下調(diào)Iloprost所促進的RORC mRNA的表達和CD4+IL-17+T細胞的數(shù)量及I

22、L-17A的分泌（P＜0.05）。相對而言，二者的聯(lián)合作用強于單獨作用。
　　以上結(jié)果表明，MTX和HCQ單獨及聯(lián)合作用均可不同程度地上調(diào)被PGI2類似物抑制的Treg細胞分化，而下調(diào)被PGI2類似物促進的Th17細胞分化，二者的聯(lián)合作用強于單獨作用，推測MTX和HCQ可能通過糾正PGs所致的Treg/Th17失衡而發(fā)揮治療RA等自身免疫病的作用。
　　3.PGI2類似物調(diào)節(jié)Treg/Th17細胞分化的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制及MTX和

23、HCQ對該通路的影響
　　目的:PGI2通過結(jié)合G蛋白偶聯(lián)受體IP發(fā)揮其生物學(xué)作用，IP受體活化可引起胞內(nèi)cAMP水平升高及下游PKA活化。STAT3和STAT5分別是調(diào)節(jié)Th0細胞向Treg和Th17分化的關(guān)鍵核轉(zhuǎn)錄因子。然而，cAMP-PKA信號通路的活化有可能導(dǎo)致STAT3和STAT5磷酸化水平的變化。本部分研究探索Iloprost對T細胞分化的調(diào)節(jié)過程中，cAMP-PKA信號通路、STAT3和STAT5分子所發(fā)揮的作用，以

24、及MTX及HCQ對Iloprost所活化的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響，以進一步探索PGI2在RA發(fā)病中的免疫調(diào)節(jié)機制及MTX和HCQ的治療機制。
　　方法:CD4+CD45RA+T細胞的分選同第一部分。(1)收集分選的細胞，分別按照Treg和Th17細胞誘導(dǎo)方案培養(yǎng)7天，將誘導(dǎo)成功的Treg和Th17細胞分別分為七組:Control組（單純誘導(dǎo)組）;Iloprost組;CAY10449+Iloprost組; Iloprost+MTX組;

25、Iloprost+HCQ組;Iloprost+MTX+HCQ組;db-cAMP組，用免疫熒光法測定胞內(nèi)cAMP含量。(2) cAMP-PKA信號通路在Iloprost調(diào)節(jié)Treg和Th17細胞分化中的作用:將分選后收集的細胞各分為四組:Control組（單純誘導(dǎo)組）;Iloprost組;db-cAMP組;H-89+Iloprost組，按照上述Treg和Th17細胞誘導(dǎo)方案分別培養(yǎng)7天，收集細胞，用RT-PCR檢測FoxP3或RORC m

26、RNA的表達;流式細胞術(shù)測定CD25+FoxP3+T或CD4+IL-17+T細胞數(shù)量;用ELISA方法測定Th17分化細胞上清中IL-17A含量。(3)收集分選的細胞，加入anti-CD3和anti-CD28抗體，將細胞分別分為八組:Control組;Iloprost組;CAY10449+Iloprost組; Iloprost+MTX組; Iloprost+HCQ組;Il opro st+MTX+HCQ組;db-cAMP組;H-89+I

27、loprost組，于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)20h，然后加入3μl IL-2或IL-6，37℃孵育30min，用Phowsflow技術(shù)分別檢測各組細胞中STAT5或STAT3的磷酸化水平。
　　結(jié)果:
　　(1) Iloprost可分別使得誘導(dǎo)培養(yǎng)7天的Treg和Th17細胞內(nèi)的cAMP水平增加近4倍和6倍多(P＜0.05)，作為陽性對照的db-cAMP也產(chǎn)生了類似的結(jié)果，而IP拮抗劑卻可以非常有效地阻斷Iloprost

28、對cAMP含量產(chǎn)生的影響。MTX和HCQ單獨及聯(lián)合作用均不同程度地降低了Iloprost所上調(diào)的Treg和Th17胞內(nèi)cAMP水平(P＜0.05)，其中MTX+HCQ組和單獨HCQ組的抑制作用較強。
　　(2) db-cAMP模擬了Iloprost降低CD25+FoxP3+T細胞數(shù)量和FoxP3 mRNA水平，及增加CD4+IL-17+T細胞數(shù)量和RORC轉(zhuǎn)錄水平以及IL-17A分泌的作用(P＜0.05)，而采用特異的PKA抑制劑

29、H-89阻斷cAMP-PKA信號通路，可大大削弱Iloprost對Treg和Th17細胞分化的調(diào)節(jié)作用。
　　(3) Iloprost促進了IL-6所致的STAT3磷酸化，但抑制了IL-2所致的STAT5磷酸化，CAY10449可以明顯削弱Iloprost的上述作用效應(yīng)。MTX和HCQ單獨及聯(lián)合作用均不同程度地增加了Iloprost所下調(diào)的STAT5磷酸化水平，且降低Iloprost所上調(diào)的STAT3磷酸化水平(P＜0.05)。<

30、br>　　(4) db-cAMP模擬了Iloprost抑制IL-2所致的STAT5磷酸化，及促進IL-6所致的STAT3磷酸化的作用。而用H-89阻斷cAMP-PKA之后再加入Iloprost，p-STAT5水平明顯增加，p-STAT3水平明顯降低，與Iloprost組相比，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　以上結(jié)果表明，PGI2-IP可能通過上調(diào)cAMP-PKA信號通路，從而上調(diào)p-STAT3而下調(diào)p-STAT5表達，

31、進而促進Th17細胞而抑制Treg細胞分化。而MTX和HCQ單獨及聯(lián)合作用均可顯著削弱PGI2-IP在上述信號通路中的調(diào)節(jié)作用，推測MTX和HCQ可能通過拮抗PGs與其受體結(jié)合后引發(fā)的cAMP-PKA-STAT3/STAT5信號通路，而糾正PGs所致的Treg/Th17失衡，從而發(fā)揮治療RA等自身免疫病的作用。
　　結(jié)論：本研究使用磁珠分選健康人外周血來源的na(i)ve CD4+T細胞，體外分別誘導(dǎo)其向Treg和Th17細胞分化

32、，檢測PGI2類似物對Treg和Th17細胞分化的調(diào)節(jié)作用，并且探索cAMP-PKA信號通路，STAT3和STAT5分子在其調(diào)節(jié)過程中的作用，同時觀察MTX和HCQ對PGI2所致的上述調(diào)節(jié)作用及相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響，得出以下結(jié)論:
　　1.本實驗首次在細胞水平證實PGI2類似物抑制Treg細胞體外分化，同時促進Th17細胞分化，二者的共同作用可誘導(dǎo)外周血T細胞亞群的紊亂，進而促進T細胞介導(dǎo)的自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展。
　　

33、2.PGI2類似物上述作用主要由IP受體介導(dǎo)，可能通過其上調(diào)cAMP-PKA信號通路，從而上調(diào)STAT3磷酸化而下調(diào)STAT5的磷酸化所致。
　　3.MTX和/或HCQ均可削弱PGI2類似物對上述信號通路的調(diào)節(jié)作用，進而逆轉(zhuǎn)PGI2類似物對Treg和Th17細胞分化的影響，也就是說MTX和HCQ可能通過糾正Treg/Th17分化失衡而發(fā)揮治療RA等自身免疫性疾病的作用。
　　總之，PGI2-IP通過抑制Treg細胞分化和促進