化學(xué)修飾的iGb3類似物優(yōu)勢誘導(dǎo)NKT細(xì)胞分泌IFN-γ.pdf

1、目的：自然殺傷T細(xì)胞(naturalkillerTcells，NKT)是免疫細(xì)胞中一類具有特定標(biāo)志的T淋巴細(xì)胞亞群，也是機(jī)體重要的免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞。細(xì)胞表面可以共表達(dá)NK細(xì)胞和T細(xì)胞的表面標(biāo)記分子：α/βTCR與NK1.1、CD16、LX49A、LX49C等。NKT細(xì)胞表面半恒定TCR的表達(dá)具有高度的限制性。與B細(xì)胞和傳統(tǒng)T細(xì)胞不同，NKT細(xì)胞不能識別由主要組織相容性復(fù)合物(MHC)遞呈的多肽，只能特異性識別由抗原遞呈細(xì)胞表面CD1d分子所

2、遞呈的糖脂類分子，NKT細(xì)胞活化后能夠迅速分泌大量的Th1(IFN-γ)型和Th2(IL-4)型細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子是NKT細(xì)胞執(zhí)行免疫調(diào)節(jié)功能的關(guān)鍵分子，在固有免疫和獲得性免疫間發(fā)揮著橋梁作用。近年來關(guān)于NKT細(xì)胞功能和調(diào)節(jié)的研究引起了人們極大的興趣，成為免疫學(xué)研究的一個新熱點(diǎn)。 研究發(fā)現(xiàn)，一種來源于海洋生物海綿提取物的糖脂類物質(zhì)--α-半乳糖神經(jīng)酰胺(α-Galactosylceramide，α-GalCer)具有直接激活

3、NKT細(xì)胞的能力，是公認(rèn)的NKT細(xì)胞外源性配體。大量動物實(shí)驗(yàn)證實(shí)了α-GalCer在抗腫瘤及調(diào)節(jié)自身免疫性疾病過程中的積極作用。但是，隨著研究的深入，人們越來越深刻地意識到α-GalCer這種強(qiáng)大的NKT細(xì)胞激活劑所帶來的副作用，主要包括：誘導(dǎo)NKT細(xì)胞無能、造成急性肝臟損傷、導(dǎo)致動物流產(chǎn)、加重粥樣硬化等等。最近，Zhou等報道了一個內(nèi)源性NKT細(xì)胞配體iGb3，也具有活化小鼠和人NKT細(xì)胞的作用，但其激活作用遠(yuǎn)差于外源性配體α-Gal

4、Cer。因此有目的的對糖脂進(jìn)行改造或?qū)ふ移渌鸑KT細(xì)胞激活劑已成為應(yīng)用糖脂類藥物進(jìn)行臨床治療所亟需。 基于此目的，我們將糖脂α-GalCer和iGb3分子進(jìn)行適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)修飾和改造，通過比較α-GalCer與經(jīng)過化學(xué)修飾的糖脂類似物結(jié)構(gòu)上的差異，觀察它們激活NKT細(xì)胞能力的不同，希望從中篩選出優(yōu)勢誘導(dǎo)Th1或者Th2細(xì)胞因子分泌的類似物，深入探討Th1/Th2反應(yīng)偏移的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，為今后合理設(shè)計糖脂藥物并應(yīng)用于臨床抗腫瘤和抗感染治療

5、打下基礎(chǔ)。 方法： (1)ELISA法篩選具有Th1/Th2型細(xì)胞因子分泌優(yōu)勢的α-GalCer和iGb3類似物。將6-8周齡成年C57BL/6雄鼠分組，每組設(shè)三只小鼠，通過腹腔給藥的方法，分別注射5種α-GalCer。類似物和7種iGb3類似物，在給藥后不同時間點(diǎn)收集小鼠血清，通過血清的ELISA檢測，動態(tài)觀察藥物對小鼠血清中Th1型細(xì)胞因子IFN-γ和Th2型細(xì)胞因子IL-4分泌的影響，篩選具有優(yōu)勢誘導(dǎo)Th1型或者T

6、h2型細(xì)胞因子分泌能力的α-GalCer和iGb3類似物。 (2)證實(shí)所篩選出的iGb3類似物能夠活化小鼠NKT細(xì)胞，發(fā)揮優(yōu)勢誘導(dǎo)作用。將ELISA法篩選出的兩種具有Th1型細(xì)胞因子分泌優(yōu)勢的iGb3類似物注射到小鼠體內(nèi)，在給藥后不同時間點(diǎn)處死小鼠，同時分離小鼠肝臟和脾臟淋巴細(xì)胞，通過流式細(xì)胞儀檢測用藥后小鼠肝臟和脾臟中NKT細(xì)胞的數(shù)量變化情況，分析肝臟NKT細(xì)胞早期活化標(biāo)志CD69分子的表達(dá)情況。 (3)證明所篩選出的

7、兩種iGb3類似物能夠優(yōu)勢誘導(dǎo)活化肝臟和脾臟NKT細(xì)胞分泌IFN-γ。將篩選出的兩種具有Th1型細(xì)胞因子分泌優(yōu)勢的iGb3類似物注射到小鼠體內(nèi)，在用藥后不同時間點(diǎn)處死小鼠，分離小鼠肝臟和脾臟淋巴細(xì)胞，通過流式細(xì)胞儀檢測小鼠肝臟和脾臟NKT細(xì)胞群中產(chǎn)生IFN-γ和IL-4的陽性細(xì)胞比例情況。 (4)觀察所篩選出的具有優(yōu)勢誘導(dǎo)NKT細(xì)胞Th1型細(xì)胞因子分泌能力的iGb3類似物的抗腫瘤作用。分離培養(yǎng)C57BL/6小鼠骨髓來源的DC細(xì)胞

8、，將其負(fù)載上糖脂4'''-dh-iGb3，共孵育后通過尾靜脈注射到荷瘤小鼠的體內(nèi)，分別在荷瘤后第一周和第四周觀察腫瘤的生長情況。 結(jié)果： 一、4-HO-iGb3和4'''-dh-iGb3具有優(yōu)勢誘導(dǎo)Th1型細(xì)胞因子分泌的能力。 收集給藥后不同時間點(diǎn)(4h、6h、12h、24h、48h)C57BL/6小鼠尾靜脈血，離心吸取血清，雙抗體夾心酶聯(lián)免疫法(ELISA)檢測藥物作用后小鼠血清中IFN-γ和IL-4的分泌情況

9、。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過化學(xué)修飾的兩種iGb3類似物4-HO-iGb3和4'''-dh-iGb3具有優(yōu)勢誘導(dǎo)Th1型細(xì)胞因子分泌的能力。而經(jīng)過化學(xué)修飾的幾種α-GalCer類似物誘導(dǎo)細(xì)胞因子分泌的能力較差。 二、4-HO-iGb3和4'''-dh-iGb3這兩種iGb3類似物能夠活化小鼠NKT細(xì)胞，并通過小鼠肝臟和脾臟淋巴細(xì)胞分泌IFN-γ。 分離小鼠肝臟和脾臟組織，提取肝臟和脾臟淋巴細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)分析注射PBS、iGb3、4

10、-HO-iGb3、4'''-dh-iGb3后不同時間點(diǎn)各組別小鼠肝臟和脾臟中NK1.1+CD3+(雙陽)的NKT細(xì)胞數(shù)量變化情況，同時檢測肝臟這群雙陽性細(xì)胞表面活化標(biāo)記CD69的表達(dá)情況。結(jié)果表明，給予糖脂4-HO-iGb3和4'''-dh-iGb3對NKT細(xì)胞的數(shù)量影響不大，但兩用藥組NKT細(xì)胞表面分子CD69的表達(dá)高于溶媒對照組，證實(shí)4-HO-iGb3和4'''-dh-iGb3這兩種iGb3類似物確實(shí)能夠活化NKT細(xì)胞。同時通過胞內(nèi)

11、染色檢測NK1.1+CD3+(雙陽)的NKT細(xì)胞胞內(nèi)的IFN-γ和IL-4的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)4-HO-iGb3和4'''-dh-iGb3組NKT細(xì)胞內(nèi)IFN-γ陽性的細(xì)胞比例要高于未經(jīng)過修飾的iGb3組，且IFN-γ+/IL-4+的細(xì)胞比例大于1，說明4-HO-iGb3和4'''-dh-iGb3能夠活化小鼠NKT細(xì)胞分泌IFN-γ，而以4'''-dh-iGb3的作用更為明顯。 三、DC負(fù)載的糖脂分子4'''-dh-iGb3能夠明顯

12、抑制荷瘤小鼠腫瘤的生長。 我們無菌分離C57BL/6小鼠的股骨和脛骨，加入細(xì)胞因子GM-CSF和IL-4體外誘導(dǎo)骨髓來源的DC細(xì)胞分化成熟，然后將成熟的DC細(xì)胞負(fù)載上藥物，通過小鼠尾靜脈注射到荷瘤小鼠體內(nèi)，觀察DC細(xì)胞負(fù)載的藥物對荷瘤小鼠腫瘤的生長情況的影響，發(fā)現(xiàn)DC細(xì)胞負(fù)載的4'''-dh-iGb3組與DC+iGb3組、DC+溶媒組相比較能夠有效的抑制小鼠黑色素瘤的生長，起到抑瘤作用。 結(jié)論： (1)化學(xué)修飾的