GLP-1類似物對(duì)高糖刺激的心肌細(xì)胞血管緊張素Ⅱ水平的影響及可能機(jī)制.pdf

1、目的:
　　心血管疾病作為糖尿病(DM)的主要并發(fā)癥，是DM患者的主要死因。近年的研究表明，糖尿病心肌病(DCM)與DM患者心血管疾病的高發(fā)病率和高死亡率密切相關(guān)。過度激活的腎素血管緊張素系統(tǒng)(RAS)在DCM的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。有文獻(xiàn)報(bào)道，高糖刺激能夠激活磷酸化p-p38MAPK(p-p38MAPK)蛋白以促進(jìn)血管緊張素原(AGT)基因的表達(dá)。高糖狀態(tài)下，局部RAS的主要效應(yīng)成分血管緊張素Ⅱ(ANGⅡ)的表達(dá)明顯增加，但p

2、-p38MAPK與ANGⅡ之間是否具有關(guān)聯(lián)尚不清楚。前期工作發(fā)現(xiàn)，胰高糖素樣肽1(GLP-1)可顯著改善糖尿病大鼠心肌的病理病變包括心肌細(xì)胞凋亡及心肌間質(zhì)纖維化，而這些病理改變的發(fā)生、發(fā)展與心肌局部RAS的活性增高有著密切聯(lián)系。研究發(fā)現(xiàn)Exendin-4（GLP-1受體激動(dòng)劑）能夠抑制脂毒性引起的p-p38MAPK的激活來保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞。GLP-1是否能夠抑制高糖狀態(tài)下p38MAPK介導(dǎo)的心肌局部ANGⅡ的表達(dá)，來發(fā)揮心肌保護(hù)作用尚未見文

3、獻(xiàn)報(bào)道。故本研究擬以H9c2大鼠心肌細(xì)胞為研究對(duì)象，探討在高糖狀態(tài)下，p-p38MAPK蛋白在心肌局部ANGⅡ表達(dá)中的作用以及GLP-1類似物利拉魯肽對(duì)ANGⅡ表達(dá)的影響，并初步探索p-p38MAPK在GLP-1影響心肌細(xì)胞ANGⅡ表達(dá)中所扮演的角色，從而為臨床防治DCM、降低DM患者心血管疾病死亡率提高新的策略。
　　方法:
　　1.培養(yǎng)H9c2心肌細(xì)胞，分為低糖組（D-葡萄糖5.5mmol/L）、高糖組（D-葡萄糖25m

4、mol/L）、高糖+p38MAPK抑制劑組(D-葡萄糖25mmol/L+S B20358010umol/L)、高滲組（D-葡萄糖5.5mmol/L+甘露醇19.5mmol/L），分別于0、12、24、48小時(shí)收集細(xì)胞，使用血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ，ANGⅡ)ELISA試劑盒檢測(cè)細(xì)胞上清液及裂解液中ANGⅡ濃度。
　　2.培養(yǎng)H9c2細(xì)胞，分為低糖組（NG組）、高糖組（HG組）、高糖+利拉魯肽干預(yù)組（L10組:10nM

5、利拉魯肽;L100組:100nM利拉魯肽;L1000組:1000nM利拉魯肽），干預(yù)24小時(shí)后收集細(xì)胞，使用ANGⅡELISA試劑盒檢測(cè)細(xì)胞上清及裂解液中ANGⅡ濃度。
　　3.培養(yǎng)H9c2心肌細(xì)胞，分為低糖組（A組）、高糖組（B組）、高糖+利拉魯肽干預(yù)組（C組:100nM利拉魯肽）、高糖+p38MAPK抑制劑(D組:SB20358010umol/L)，于24小時(shí)后收集細(xì)胞提取蛋白，用Western Blotting方法檢測(cè)p-p

6、38MAPK的蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1.高糖分別刺激H9c2大鼠心肌細(xì)胞12h、24h、48h。發(fā)現(xiàn)與低糖組相比，高糖刺激24h、48h后，細(xì)胞上清液及裂解液中ANGⅡ水平均顯著升高(P＜0.01)，而高滲組細(xì)胞上清液及裂解液中ANGⅡ水平在12h、24h、48h均無顯著差異(P＞0.05)。
　　2.與低糖組相比，高糖刺激24h后，心肌細(xì)胞p-p38MAPK蛋白表達(dá)顯著增高(1.0900±0.04359vs0.

7、6400±0.06254,P＜0.01)。
　　3.給予H9c2大鼠心肌細(xì)胞p38MAPK抑制劑SB203580預(yù)處理后，高糖分別干預(yù)12h、24h、48h。發(fā)現(xiàn)與高糖組相比，SB203580預(yù)處理后給予高糖干預(yù)24h、48h組細(xì)胞上清液及裂解液中ANGⅡ水平顯著下降（P＜0.05）。
　　4.在高糖狀態(tài)下，分別給予H9c2大鼠心肌細(xì)胞10nM、100nM、1000nM利拉魯肽干預(yù)24h。發(fā)現(xiàn)與高糖組相比，利拉魯肽干預(yù)后細(xì)胞

8、裂解液中ANGⅡ水平均顯著下降(P＜0.01)，但細(xì)胞上清液中ANGⅡ水平無明顯差異(P＞0.05)。
　　5.在高糖狀態(tài)下，給予H9c2大鼠心肌細(xì)胞100nM利拉魯肽干預(yù)24h。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與高糖組相比，利拉魯肽干預(yù)后p-p38MAPK蛋白表達(dá)明顯下降（0.5167±0.05686vs1.0900±0.04359，P＜0.01）;與SB203580干預(yù)后相比無明顯差異（0.5167±0.05686vs0.0500±0.02828，P