瑞舒伐他汀對(duì)兔動(dòng)脈粥樣硬化斑塊內(nèi)CD147的表達(dá)及斑塊穩(wěn)定性的影響.pdf

1、心腦血管疾病因其具有很高的發(fā)病率和死亡率，成為目前威脅人類健康的重要?dú)⑹?。?dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是眾多的心腦血管疾?。ü谛牟?、腦卒中等）發(fā)生發(fā)展的重要病理基礎(chǔ)。動(dòng)脈粥樣硬化的形成是由多種因素（如高血壓、高脂血癥、高血糖、吸煙等）導(dǎo)致了動(dòng)脈血管的內(nèi)皮功能紊亂，平滑肌細(xì)胞發(fā)生增殖、遷移，動(dòng)脈血管壁發(fā)生炎癥反應(yīng)，繼而形成粥樣硬化斑塊，在動(dòng)脈硬化的發(fā)生發(fā)展過程中，炎癥反應(yīng)貫穿始終。目前隨著生活水平的普遍提高，多種高

2、危因素如糖尿病、高脂血癥的患病率逐年升高，使動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病率、死亡率增加，嚴(yán)重威脅人類健康及生活。目前國內(nèi)外許多學(xué)者針對(duì)關(guān)于動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病機(jī)制做了大量的研究工作，提出了許多假說，如脂質(zhì)學(xué)說、血栓學(xué)說、炎癥反應(yīng)學(xué)說和損傷學(xué)說等。明確動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制對(duì)于尋求預(yù)防措施和治療手段顯得至關(guān)重要。目前的研究認(rèn)為，動(dòng)脈粥樣硬化性疾病是動(dòng)脈管壁長(zhǎng)期慢性進(jìn)展性炎癥性病變，其特征由富含脂質(zhì)的粥樣核心內(nèi)有炎癥細(xì)胞聚集以及其表面覆蓋的纖維帽構(gòu)成。從

3、病理學(xué)上觀察斑塊穩(wěn)定與否與纖維帽的厚度、炎癥細(xì)胞的聚集程度及膠原組織的含量多少密切相關(guān)。而目前的研究證實(shí)，斑塊內(nèi)炎癥反應(yīng)的程度是導(dǎo)致纖維帽變薄、斑塊不穩(wěn)定的最為重要的因素。由于炎癥介質(zhì)刺激斑塊內(nèi)炎癥細(xì)胞活化，后者表達(dá)和分泌大量基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs），導(dǎo)致斑塊內(nèi)包括膠原在內(nèi)的細(xì)胞外基質(zhì)降解，纖維帽變薄，使斑塊不穩(wěn)定，易于破裂，從而產(chǎn)生急性心腦血管事件。
　　 基質(zhì)金屬蛋白酶是

4、一組由平滑肌細(xì)胞和巨噬細(xì)胞分泌和表達(dá)的鋅離子依賴性內(nèi)肽酶的總稱。MMPs的活性很大程度上決定了動(dòng)脈粥樣硬化斑塊纖維帽厚度及其膠原含量。在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展中，基質(zhì)金屬蛋白酶通過降解易損斑塊的纖維帽，從而在斑塊形成和斑塊破裂出血的發(fā)生中都起非常重要的作用。因此，MMPs與動(dòng)脈粥樣斑塊穩(wěn)定性的研究已成為目前研究的熱點(diǎn)之一。動(dòng)脈粥樣硬化斑塊內(nèi)的MMPs主要是由巨噬細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞分泌，已發(fā)現(xiàn)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞聚積區(qū)有大量的MMPs

5、存在。MMP-2、MMP-9屬于基質(zhì)金屬蛋白酶的明膠酶類，是目前研究較多且對(duì)斑塊穩(wěn)定性影響較為明確的兩種基質(zhì)金屬蛋白酶。目前對(duì)于MMPs表達(dá)和功能調(diào)控的的信號(hào)通路還并不十分清楚，除受內(nèi)源特異性細(xì)胞外抑制劑調(diào)節(jié)外，還受轉(zhuǎn)錄水平和酶原激活等形式調(diào)節(jié)。
　　 CD147分子是一種高度糖基化的、廣泛表達(dá)的跨膜糖蛋白，最初是從肺癌細(xì)胞系LX-1中分離出來，屬于免疫球蛋白超家族的成員。CD147分子是基質(zhì)金屬蛋白酶的上游調(diào)控因子，它能夠以旁

6、分泌的方式在多種細(xì)胞質(zhì)誘導(dǎo)產(chǎn)生過過度MMPs，通過降解細(xì)胞外基質(zhì)中膠原蛋白，從而促進(jìn)細(xì)胞轉(zhuǎn)移和免疫性疾病的炎癥活動(dòng)。目前研究發(fā)現(xiàn)CD147可以在平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、單核細(xì)胞等多種細(xì)胞中誘導(dǎo)金屬基質(zhì)蛋白酶的產(chǎn)生，其包括MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-9、1型跨膜基質(zhì)金屬蛋白酶蛋白(Membrane Type1 MatrixMetalloproteinase，MT-MMP)等，由此我們推測(cè)斑塊內(nèi)CD147通過影響刪Ps的表達(dá)，

7、對(duì)斑塊穩(wěn)定性可能起到重要作用。
　　 他汀類是目前治療心腦血管疾病的常用藥物，其對(duì)心腦血管病的治療作用除了依靠其降脂作用外，還得益于多種非調(diào)脂作用，如抑制平滑肌細(xì)胞的增生、增加一氧化氮的生物合成、改善血管內(nèi)皮功能、逆轉(zhuǎn)血管重構(gòu)、抑制血栓形成、抗炎作用、抗氧化和穩(wěn)定動(dòng)脈粥樣硬化斑塊等，這些作用在動(dòng)脈粥樣硬化的防治中占有重要地位。他汀類降脂藥的多效性作用越來越受到關(guān)注，其抗炎作用是目前研究的熱點(diǎn)之一。瑞舒伐他汀作為一種新型的降脂藥物

8、在臨床上廣泛應(yīng)用，其除了具有強(qiáng)大的降脂作用外，還可在抑制炎癥反應(yīng)、改善血管內(nèi)皮功能、穩(wěn)定斑塊等方面發(fā)揮重要作用。
　　 近年來，隨著他汀藥物在臨床的廣泛應(yīng)用，降低了心腦血管疾病的發(fā)生率和病死率。本研究通過建立兔頸動(dòng)脈粥樣硬化易損斑塊模型，探討血清炎癥因子濃度水平變化、斑塊內(nèi)CD147的表達(dá)水平與斑塊穩(wěn)定性的關(guān)系，探索瑞舒伐他汀穩(wěn)定斑塊的機(jī)制。
　　 目的:
　　 1、利用液氮凍傷聯(lián)合高脂飲食喂養(yǎng)創(chuàng)建與人動(dòng)脈粥樣硬

9、化斑塊相似的兔頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊模型，為研究動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的病理基礎(chǔ)及干預(yù)治療奠定基礎(chǔ)。
　　 2、在上述自創(chuàng)的兔動(dòng)脈粥樣硬化模型基礎(chǔ)上，探討瑞舒伐他汀對(duì)兔頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊內(nèi)的CD147表達(dá)水平、外周血清金屬基質(zhì)蛋白酶-2(MMP-2)、金屬基質(zhì)蛋白酶-9(MMP-9)的濃度水平以及斑塊穩(wěn)定性的影響。
　　 方法:
　　 1、動(dòng)物模型的建立健康純種雄性新西蘭白兔18只，將動(dòng)物采用抽簽法隨機(jī)分為3組，分別為:A

10、組為空白對(duì)照組:普通飼料喂養(yǎng);B組為模型對(duì)照組:造模+高脂飼料喂養(yǎng);C組為藥物干預(yù)組:造模+高脂飼料+瑞舒伐他汀鈣片(2.5mg/kg/d)。普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)7天后，對(duì)模型對(duì)照組及藥物干預(yù)組實(shí)施右頸動(dòng)脈內(nèi)膜液氮凍傷術(shù)，術(shù)后模型對(duì)照組及藥物干預(yù)組高脂飼料喂養(yǎng)13周，行右側(cè)頸動(dòng)脈內(nèi)膜液氮激發(fā)術(shù)，繼續(xù)喂養(yǎng)1周后處死。空白對(duì)照組一直給予普通飼料喂養(yǎng)。
　　 2、瑞舒伐他汀藥物干預(yù)藥物干預(yù)組第1次術(shù)后第一天，開始瑞舒伐他汀灌胃給藥，每只

11、兔按2.5mg/kg計(jì)算給藥，稀釋于10ml生理鹽水灌胃，每日一次。其他兩組予同等劑量的生理鹽水。
　　 3、分別于實(shí)驗(yàn)前、15周末采血，采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP-2）、基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP-9）的水平。
　　 4、15周末時(shí)處死所有動(dòng)物，取出實(shí)驗(yàn)血管作HE染色、Masson三色染色和彈力纖維染色，光鏡下觀察實(shí)驗(yàn)血管病理形態(tài)學(xué)特點(diǎn)。應(yīng)用MMP-2、MMP-9的單克隆抗體對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血

12、管進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，以明確斑塊局部金屬基質(zhì)蛋白酶系列蛋白表達(dá)情況。逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)斑塊內(nèi)CD147mRNA表達(dá)水平及蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測(cè)斑塊內(nèi)CD147蛋白表達(dá)水平。
　　 5、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)描述與分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩配對(duì)樣本均數(shù)總體比較時(shí)采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)。多個(gè)樣本均數(shù)總體比較采用One-way ANOVA（方差不齊時(shí)多個(gè)樣本

13、均數(shù)總體比較采用Brown-Forsythe法檢驗(yàn)，對(duì)自由度進(jìn)行校正后在進(jìn)行比較）;方差齊時(shí)多個(gè)樣本均數(shù)間的多重比較采用LSD檢驗(yàn)（方差不齊時(shí)樣本均數(shù)間的多重比較采用Dunnett'sT3檢驗(yàn)），認(rèn)為P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 1、兔總體生長(zhǎng)良好。所有18只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物全部完成實(shí)驗(yàn)，其中B組2只兔子第2次液氮激發(fā)術(shù)后（14周末）出現(xiàn)腦梗塞。所得18只動(dòng)物數(shù)據(jù)參與分析。A組6只，B組6只，C組6只。<

14、br>　　 2、血清MMP-2濃度變化:實(shí)驗(yàn)前，各組兔血清MMP-2水平無顯著性差異(P＞0.05)。第15周末，空白對(duì)照組MMP-2水平與同組實(shí)驗(yàn)前相比，無顯著性差異(P＞0.05);模型對(duì)照組和藥物干預(yù)組MMP-2與同組實(shí)驗(yàn)前相比，有顯著性差異(P＜0.05)，表現(xiàn)為其MMP-2水平較實(shí)驗(yàn)前分別明顯升高。第15周末模型對(duì)照組和藥物干預(yù)組MMP-2水平有顯著性差異，表現(xiàn)為藥物干預(yù)組MMP-2水平明顯低于模型對(duì)照組(P＜0.05)。<

15、br>　　 3、血清MMP-9濃度變化:實(shí)驗(yàn)前，各組兔血清MMP-2水平無顯著性差異(P＞0.05)。第15周末，空白對(duì)照組MMP-2水平與同組實(shí)驗(yàn)前相比，無顯著性差異(P＞0.05);模型對(duì)照組和藥物干預(yù)組MMP-2與同組實(shí)驗(yàn)前相比，有顯著性差異(P＜0.05)，表現(xiàn)為其MMP-2水平較實(shí)驗(yàn)前分別明顯升高。第15周末模型對(duì)照組和藥物干預(yù)組MMP-2水平有顯著性差異，表現(xiàn)為藥物干預(yù)組MMP-2水平明顯低于模型對(duì)照組(P＜0.05)。<

16、br>　　 4、RT-PCR結(jié)果:各組均可檢測(cè)到CD147 mRNA表達(dá)，各組CD147mRNA表達(dá)量均有顯著性差異(P＜0.05)，表現(xiàn)為模型對(duì)照組CD147mRNA表達(dá)量最高，空白對(duì)照組CD147mRNA表達(dá)量最低，而藥物干預(yù)組CD147mRNA表達(dá)量介于上述兩組之間。模型對(duì)照組與空白對(duì)照組相比，CD147mRNA表達(dá)量升高19.5倍。藥物干預(yù)組與模型對(duì)照組相比，CD147mRNA表達(dá)量降低45.3％。
　　 5、West

17、ern blot結(jié)果:各組均可檢測(cè)到CD147蛋白表達(dá)，各組CD147蛋白含量均有顯著性差異(P＜0.05)，表現(xiàn)為空白對(duì)照組頸動(dòng)脈局部CD147蛋白含量最低，模型對(duì)照組CD147蛋白含量最高，而藥物干預(yù)組CD147蛋白含量介于上述兩組之間。模型對(duì)照組與空白對(duì)照組相比，CD147蛋白表達(dá)量升高1.37倍。藥物干預(yù)組與模型對(duì)照組相比，CD147蛋白表達(dá)量降低17.5％。
　　 結(jié)論:
　　 動(dòng)脈易損斑塊局部CD147的表達(dá)