瑞舒伐他汀對兔動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)CD147的表達及斑塊穩(wěn)定性的影響.pdf

1、心腦血管疾病因其具有很高的發(fā)病率和死亡率，成為目前威脅人類健康的重要殺手。動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是眾多的心腦血管疾?。ü谛牟　⒛X卒中等）發(fā)生發(fā)展的重要病理基礎(chǔ)。動脈粥樣硬化的形成是由多種因素（如高血壓、高脂血癥、高血糖、吸煙等）導致了動脈血管的內(nèi)皮功能紊亂，平滑肌細胞發(fā)生增殖、遷移，動脈血管壁發(fā)生炎癥反應，繼而形成粥樣硬化斑塊，在動脈硬化的發(fā)生發(fā)展過程中，炎癥反應貫穿始終。目前隨著生活水平的普遍提高，多種高

2、危因素如糖尿病、高脂血癥的患病率逐年升高，使動脈粥樣硬化的發(fā)病率、死亡率增加，嚴重威脅人類健康及生活。目前國內(nèi)外許多學者針對關(guān)于動脈粥樣硬化發(fā)病機制做了大量的研究工作，提出了許多假說，如脂質(zhì)學說、血栓學說、炎癥反應學說和損傷學說等。明確動脈粥樣硬化的發(fā)病機制對于尋求預防措施和治療手段顯得至關(guān)重要。目前的研究認為，動脈粥樣硬化性疾病是動脈管壁長期慢性進展性炎癥性病變，其特征由富含脂質(zhì)的粥樣核心內(nèi)有炎癥細胞聚集以及其表面覆蓋的纖維帽構(gòu)成。從

3、病理學上觀察斑塊穩(wěn)定與否與纖維帽的厚度、炎癥細胞的聚集程度及膠原組織的含量多少密切相關(guān)。而目前的研究證實，斑塊內(nèi)炎癥反應的程度是導致纖維帽變薄、斑塊不穩(wěn)定的最為重要的因素。由于炎癥介質(zhì)刺激斑塊內(nèi)炎癥細胞活化，后者表達和分泌大量基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs），導致斑塊內(nèi)包括膠原在內(nèi)的細胞外基質(zhì)降解，纖維帽變薄，使斑塊不穩(wěn)定，易于破裂，從而產(chǎn)生急性心腦血管事件。
　　 基質(zhì)金屬蛋白酶是

4、一組由平滑肌細胞和巨噬細胞分泌和表達的鋅離子依賴性內(nèi)肽酶的總稱。MMPs的活性很大程度上決定了動脈粥樣硬化斑塊纖維帽厚度及其膠原含量。在動脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展中，基質(zhì)金屬蛋白酶通過降解易損斑塊的纖維帽，從而在斑塊形成和斑塊破裂出血的發(fā)生中都起非常重要的作用。因此，MMPs與動脈粥樣斑塊穩(wěn)定性的研究已成為目前研究的熱點之一。動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)的MMPs主要是由巨噬細胞及平滑肌細胞分泌，已發(fā)現(xiàn)動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)巨噬細胞聚積區(qū)有大量的MMPs

5、存在。MMP-2、MMP-9屬于基質(zhì)金屬蛋白酶的明膠酶類，是目前研究較多且對斑塊穩(wěn)定性影響較為明確的兩種基質(zhì)金屬蛋白酶。目前對于MMPs表達和功能調(diào)控的的信號通路還并不十分清楚，除受內(nèi)源特異性細胞外抑制劑調(diào)節(jié)外，還受轉(zhuǎn)錄水平和酶原激活等形式調(diào)節(jié)。
　　 CD147分子是一種高度糖基化的、廣泛表達的跨膜糖蛋白，最初是從肺癌細胞系LX-1中分離出來，屬于免疫球蛋白超家族的成員。CD147分子是基質(zhì)金屬蛋白酶的上游調(diào)控因子，它能夠以旁

6、分泌的方式在多種細胞質(zhì)誘導產(chǎn)生過過度MMPs，通過降解細胞外基質(zhì)中膠原蛋白，從而促進細胞轉(zhuǎn)移和免疫性疾病的炎癥活動。目前研究發(fā)現(xiàn)CD147可以在平滑肌細胞、內(nèi)皮細胞、單核細胞等多種細胞中誘導金屬基質(zhì)蛋白酶的產(chǎn)生，其包括MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-9、1型跨膜基質(zhì)金屬蛋白酶蛋白(Membrane Type1 MatrixMetalloproteinase，MT-MMP)等，由此我們推測斑塊內(nèi)CD147通過影響刪Ps的表達，

7、對斑塊穩(wěn)定性可能起到重要作用。
　　 他汀類是目前治療心腦血管疾病的常用藥物，其對心腦血管病的治療作用除了依靠其降脂作用外，還得益于多種非調(diào)脂作用，如抑制平滑肌細胞的增生、增加一氧化氮的生物合成、改善血管內(nèi)皮功能、逆轉(zhuǎn)血管重構(gòu)、抑制血栓形成、抗炎作用、抗氧化和穩(wěn)定動脈粥樣硬化斑塊等，這些作用在動脈粥樣硬化的防治中占有重要地位。他汀類降脂藥的多效性作用越來越受到關(guān)注，其抗炎作用是目前研究的熱點之一。瑞舒伐他汀作為一種新型的降脂藥物

8、在臨床上廣泛應用，其除了具有強大的降脂作用外，還可在抑制炎癥反應、改善血管內(nèi)皮功能、穩(wěn)定斑塊等方面發(fā)揮重要作用。
　　 近年來，隨著他汀藥物在臨床的廣泛應用，降低了心腦血管疾病的發(fā)生率和病死率。本研究通過建立兔頸動脈粥樣硬化易損斑塊模型，探討血清炎癥因子濃度水平變化、斑塊內(nèi)CD147的表達水平與斑塊穩(wěn)定性的關(guān)系，探索瑞舒伐他汀穩(wěn)定斑塊的機制。
　　 目的:
　　 1、利用液氮凍傷聯(lián)合高脂飲食喂養(yǎng)創(chuàng)建與人動脈粥樣硬

9、化斑塊相似的兔頸動脈粥樣硬化斑塊模型，為研究動脈粥樣硬化斑塊的病理基礎(chǔ)及干預治療奠定基礎(chǔ)。
　　 2、在上述自創(chuàng)的兔動脈粥樣硬化模型基礎(chǔ)上，探討瑞舒伐他汀對兔頸動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)的CD147表達水平、外周血清金屬基質(zhì)蛋白酶-2(MMP-2)、金屬基質(zhì)蛋白酶-9(MMP-9)的濃度水平以及斑塊穩(wěn)定性的影響。
　　 方法:
　　 1、動物模型的建立健康純種雄性新西蘭白兔18只，將動物采用抽簽法隨機分為3組，分別為:A

10、組為空白對照組:普通飼料喂養(yǎng);B組為模型對照組:造模+高脂飼料喂養(yǎng);C組為藥物干預組:造模+高脂飼料+瑞舒伐他汀鈣片(2.5mg/kg/d)。普通飼料適應性喂養(yǎng)7天后，對模型對照組及藥物干預組實施右頸動脈內(nèi)膜液氮凍傷術(shù)，術(shù)后模型對照組及藥物干預組高脂飼料喂養(yǎng)13周，行右側(cè)頸動脈內(nèi)膜液氮激發(fā)術(shù)，繼續(xù)喂養(yǎng)1周后處死?？瞻讓φ战M一直給予普通飼料喂養(yǎng)。
　　 2、瑞舒伐他汀藥物干預藥物干預組第1次術(shù)后第一天，開始瑞舒伐他汀灌胃給藥，每只

11、兔按2.5mg/kg計算給藥，稀釋于10ml生理鹽水灌胃，每日一次。其他兩組予同等劑量的生理鹽水。
　　 3、分別于實驗前、15周末采血，采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP-2）、基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP-9）的水平。
　　 4、15周末時處死所有動物，取出實驗血管作HE染色、Masson三色染色和彈力纖維染色，光鏡下觀察實驗血管病理形態(tài)學特點。應用MMP-2、MMP-9的單克隆抗體對實驗動物血

12、管進行免疫組織化學染色，以明確斑塊局部金屬基質(zhì)蛋白酶系列蛋白表達情況。逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測斑塊內(nèi)CD147mRNA表達水平及蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測斑塊內(nèi)CD147蛋白表達水平。
　　 5、統(tǒng)計學分析:數(shù)據(jù)應用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計學描述與分析，計量資料用均數(shù)±標準差表示，兩配對樣本均數(shù)總體比較時采用配對樣本t檢驗。多個樣本均數(shù)總體比較采用One-way ANOVA（方差不齊時多個樣本

13、均數(shù)總體比較采用Brown-Forsythe法檢驗，對自由度進行校正后在進行比較）;方差齊時多個樣本均數(shù)間的多重比較采用LSD檢驗（方差不齊時樣本均數(shù)間的多重比較采用Dunnett'sT3檢驗），認為P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　 結(jié)果:
　　 1、兔總體生長良好。所有18只實驗動物全部完成實驗，其中B組2只兔子第2次液氮激發(fā)術(shù)后（14周末）出現(xiàn)腦梗塞。所得18只動物數(shù)據(jù)參與分析。A組6只，B組6只，C組6只。<

14、br>　　 2、血清MMP-2濃度變化:實驗前，各組兔血清MMP-2水平無顯著性差異(P＞0.05)。第15周末，空白對照組MMP-2水平與同組實驗前相比，無顯著性差異(P＞0.05);模型對照組和藥物干預組MMP-2與同組實驗前相比，有顯著性差異(P＜0.05)，表現(xiàn)為其MMP-2水平較實驗前分別明顯升高。第15周末模型對照組和藥物干預組MMP-2水平有顯著性差異，表現(xiàn)為藥物干預組MMP-2水平明顯低于模型對照組(P＜0.05)。<

15、br>　　 3、血清MMP-9濃度變化:實驗前，各組兔血清MMP-2水平無顯著性差異(P＞0.05)。第15周末，空白對照組MMP-2水平與同組實驗前相比，無顯著性差異(P＞0.05);模型對照組和藥物干預組MMP-2與同組實驗前相比，有顯著性差異(P＜0.05)，表現(xiàn)為其MMP-2水平較實驗前分別明顯升高。第15周末模型對照組和藥物干預組MMP-2水平有顯著性差異，表現(xiàn)為藥物干預組MMP-2水平明顯低于模型對照組(P＜0.05)。<

16、br>　　 4、RT-PCR結(jié)果:各組均可檢測到CD147 mRNA表達，各組CD147mRNA表達量均有顯著性差異(P＜0.05)，表現(xiàn)為模型對照組CD147mRNA表達量最高，空白對照組CD147mRNA表達量最低，而藥物干預組CD147mRNA表達量介于上述兩組之間。模型對照組與空白對照組相比，CD147mRNA表達量升高19.5倍。藥物干預組與模型對照組相比，CD147mRNA表達量降低45.3％。
　　 5、West

17、ern blot結(jié)果:各組均可檢測到CD147蛋白表達，各組CD147蛋白含量均有顯著性差異(P＜0.05)，表現(xiàn)為空白對照組頸動脈局部CD147蛋白含量最低，模型對照組CD147蛋白含量最高，而藥物干預組CD147蛋白含量介于上述兩組之間。模型對照組與空白對照組相比，CD147蛋白表達量升高1.37倍。藥物干預組與模型對照組相比，CD147蛋白表達量降低17.5％。
　　 結(jié)論:
　　 動脈易損斑塊局部CD147的表達