肝癌細(xì)胞胰島素抵抗與耐藥性的關(guān)系及肝癌多藥耐藥細(xì)胞模型的建立和特性.pdf

1、目的： 研究人肝癌細(xì)胞胰島素抵抗(Insulin resistance，IR)與藥物敏感性的關(guān)系；建立肝癌多藥耐藥(Multidrug resistance，MDR)轉(zhuǎn)基因細(xì)胞模型，為探討肝癌細(xì)胞MDR與IR的相關(guān)性奠定基礎(chǔ)。 方法： 1、體外采用高濃度胰島素誘導(dǎo)人源肝癌細(xì)胞HepG2建立IR細(xì)胞模型(Insulin-resistant HepG2，HepG2/IR)，葡萄糖氧化酶-過氧化氫酶(Glucose o

2、xidase-peroxidase，GOD-POD)法測(cè)定葡萄糖消耗量，觀察HepG2/IR細(xì)胞IR持續(xù)時(shí)間；流式細(xì)胞術(shù)(Flow cytometry，F(xiàn)CM)檢測(cè)HepG2/IR細(xì)胞胰島素受體(Insulin receptor，InsR)蛋白表達(dá)和P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)表達(dá)水平；實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)HepG2/IR細(xì)胞InsR及mdrl mRNA水平；MTT比色法檢測(cè)HepG2/IR細(xì)胞對(duì)抗癌藥物阿霉素

3、(adriamycin，ADM)的敏感性，Annexin V/PI雙標(biāo)記法檢測(cè)HepG2/IR細(xì)胞的凋亡。 2、采用脂質(zhì)體介導(dǎo)法將含有人多藥耐藥基因1(mdrl)全長(zhǎng)cDNA的真核表達(dá)質(zhì)粒pCI-neo-mdrl導(dǎo)入肝癌HepG2細(xì)胞，通過G418篩選出表達(dá)mdrl基因的肝癌HepG2細(xì)胞(HepG2/mdrl)。倒置相差顯微鏡觀察HepG2/mdrl細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化；MTT比色法測(cè)定HepG2/mdrl細(xì)胞的增殖活性；FCM檢測(cè)

4、HepG2/mdrl細(xì)胞P-gp的表達(dá)及ADM的蓄積和排除；實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)HepG2/mdrl細(xì)胞mdrl mRNA的表達(dá)水平。 結(jié)果： 1、胰島素誘發(fā)HepG2發(fā)生IR后，HepG2/IR細(xì)胞葡萄糖消耗量降低16.61％～41.78％，并呈時(shí)間-濃度依賴性，IR維持時(shí)間可達(dá)48 h；胰島素誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞產(chǎn)生抗性的過程中，與HepG2細(xì)胞相比，HepG2/IR細(xì)胞InsR基因mRNA表達(dá)較HepG2細(xì)胞下降4

5、3.67％，InsR受體表達(dá)量降低69.31％；HepG2/IR細(xì)胞mdrl mRNA表達(dá)增高4.21倍，P-gp表達(dá)陽性率增高1.01倍，與細(xì)胞葡萄糖消耗量及InsR表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)。HepG2/IR細(xì)胞對(duì)ADM的敏感性降低，較HepG2細(xì)胞耐受3.2倍；HepG2/IR細(xì)胞對(duì)ADM誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡抵抗，凋亡效應(yīng)較HepG2細(xì)胞低3.5倍。 2、建立的轉(zhuǎn)基因肝癌多藥耐藥性HepG2/mdrl細(xì)胞的生長(zhǎng)速度較HepG2細(xì)胞緩慢，倍增

6、時(shí)間均為20～22h，形態(tài)學(xué)上無明顯差異；與親本HepG2細(xì)胞相比，HepG2/mdrl細(xì)胞mdrl mRNA的表達(dá)量增加5.6倍，P-gp表達(dá)陽性率增高6.7倍，表達(dá)強(qiáng)度(MFI)增加23.03％。HepG2/mdrl細(xì)胞中ADM蓄積量?jī)H為HepG2細(xì)胞的61.12％，而排出量則為HepG2細(xì)胞的192.48％。研究結(jié)果證實(shí)mdrl基因已成功導(dǎo)入HepG2細(xì)胞且能穩(wěn)定表達(dá)，轉(zhuǎn)基因肝癌多藥耐藥性HepG2/mdrl細(xì)胞模型建立成功。

7、 結(jié)論： 1、用高濃度胰島素培養(yǎng)法誘導(dǎo)人源肝癌HepG2細(xì)胞，成功建立了胰島素抵抗模型細(xì)胞(HepG2/IR細(xì)胞)； 2、胰島素抵抗肝癌細(xì)胞InsR基因mRNA和受體蛋白表達(dá)明顯降低，耐藥基因mdrl及其產(chǎn)物P-gp的表達(dá)顯著增高；HepG2/IR細(xì)胞阿霉素的敏感性降低，耐藥性增高，提示肝癌細(xì)胞多藥耐藥性與其胰島素抵抗性相關(guān)聯(lián)； 3、應(yīng)用基因轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)成功建立了肝癌多藥耐藥細(xì)胞模型(HepG2/mdrl細(xì)胞)，