端粒酶線粒體轉(zhuǎn)位與人肝癌細胞多藥耐藥關(guān)系的實驗研究.pdf

1、背景與目的：
　　 原發(fā)性肝癌是最常見的消化系統(tǒng)腫瘤之一，惡性程度高、手術(shù)切除率低。因此，化療在肝癌的綜合治療中占重要的地位。但肝癌全身化療的效果較差，腫瘤細胞多藥耐藥(multidrug resistance，MDR)是導致肝癌化療失敗的主要原因之一。
　　 MDR是指腫瘤細胞對一種抗腫瘤藥物出現(xiàn)耐藥的同時，對其他結(jié)構(gòu)及作用機制不同的抗腫瘤藥物也產(chǎn)生交叉耐藥的現(xiàn)象。MDR的發(fā)生機制比較復雜，包括增加藥物外排、減少藥物吸

2、收、抗腫瘤藥物靶位改變、藥物活化作用減弱、DNA損傷修復能力增強及抗凋亡相關(guān)通路的改變等多個方面。
　　 線粒體一個非常重要的細胞器：為機體活動提供能量、調(diào)控氧化還原、調(diào)節(jié)鈣離子濃度、介導細胞內(nèi)信號傳遞等，尤其是調(diào)節(jié)細胞凋亡和壞死，線粒體擔負著關(guān)鍵性作用。而細胞凋亡即是化療藥殺傷腫瘤細胞的共同通路。線粒體已成為篩選新型抗腫瘤藥物的靶點之一。
　　 端粒酶是一種核糖核蛋白酶，主要由3個亞單位構(gòu)成，即端粒酶RNA(telom

3、eraseRNA，TR)、端粒酶相關(guān)蛋白質(zhì)(telomerase-associated protein，TP1/TP2)和端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(telomerase reverse transcriptase，TERT)。研究表明，hTERT表達水平隨著端粒酶活性增加而相應成比例增加。hTERT是人類端粒酶活性的主要調(diào)控亞單位。
　　 端粒酶在正常人體組織表達呈陰性或陽性率很低，而在生殖細胞、胚胎干細胞和癌細胞中高表達，其主要功能是維

4、持端粒的長度。端粒酶活性高表達參與了腫瘤發(fā)生、發(fā)展的過程。端粒酶也可能通過拮抗細胞凋亡等作用參與腫瘤細胞MDR發(fā)生。過度表達TERT可能傳遞化療藥物抵抗信號。
　　 端粒酶主要存在于細胞核。研究發(fā)現(xiàn)，端粒酶除了維持端粒長度的功能外，還具有非依賴端粒的功能，如氧化應激和藥物治療可導致端粒酶從細胞核轉(zhuǎn)位到線粒體并保護線粒體功能(保護線粒體DNA、降低線粒體ROS等)并抵抗凋亡，而不能保護細胞核內(nèi)的端粒，端粒繼續(xù)縮短。由此推斷，當腫瘤

5、細胞接觸化療藥物時，端粒酶可能從細胞核內(nèi)移位到線粒體發(fā)揮線粒體保護作用，抵抗凋亡。因此，端粒酶線粒體轉(zhuǎn)位可能是腫瘤細胞發(fā)生MDR的另一機制。
　　 本研究通過建立不同耐藥程度的人肝癌耐藥細胞系SK-Hepl/CDDP1、SK-Hepl/CDDP2和SK-Hepl/CDDP3細胞，探討端粒酶線粒體轉(zhuǎn)位在腫瘤多藥耐藥過程中可能作用，期望為多藥耐藥逆轉(zhuǎn)提供新的干預手段。
　　 研究方法：本研究分兩部分：
　　 第一部分

6、：
　　 體外培養(yǎng)人肝癌細胞株SK-Hepl，采用大劑量沖擊，間歇誘導法，用順鉑誘導SK-Hepl細胞耐藥后，用極限稀釋法克隆篩選，建立不同耐藥程度的人肝癌耐藥細胞系SK-Hepl/CDDP1、SK-Hepl/CDDP2和SK-Hepl/CDDP3細胞。倒置顯微鏡比較耐藥細胞和親本細胞形態(tài)，細胞計數(shù)法比較耐藥細胞和親本細胞的生長曲線；CCK-8法檢測親本細胞株和耐藥細胞株對不同濃度的抗腫瘤藥物的藥物敏感性，計算半數(shù)抑制率(IC5

7、0)和耐藥指數(shù)(RI)；流式細胞儀檢測SK-Hepl和SK-Hepl/CDDP1、SK-Hepl/CDDP2、SK-Hepl/CDDP3的細胞周期。
　　 第二部分：
　　 免疫熒光染色及Western blot作hTERT在線粒體和細胞核的共定位分析。
　　 適時熒光定量PCR檢測線粒體DNA氧化損傷及細胞端粒長度。
　　 采用熒光探針JC-1檢測線粒體膜電位的變化。
　　 流式細胞儀檢測SK-

8、Hepl和SK-Hepl/CDDP1、SK-Hepl/CDDP2、SK-Hepl/CDDP3的細胞凋亡率。
　　 研究結(jié)果：
　　 1.耐藥細胞SK-Hepl/CDDP1、SK-Hepl/CDDP2和SK-Hepl/CDDP3細胞形態(tài)基本接近親本細胞。
　　 2.與親本細胞相比，耐藥細胞SK-Hepl/CDDP1、SK-Hepl/CDDP2和SK-Hepl/CDDP3生長緩慢，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

9、
　　 3.CCK-8法測定SK-Hepl細胞IC50為5.42±0.04μg/mL，耐藥細胞SK-Hepl/CDDP1、SK-Hepl/CDDP2和SK-Hepl/CDDP3細胞IC50分別為40.72±0.06μg/mL、50.48±1.02μg/mL、70.61±1.06μg/mL，耐藥指數(shù)分別為7.51、9.31、13.03，耐藥細胞對氟尿嘧啶(5-FU)、阿霉素(DOX)等抗腫瘤藥物顯示交叉耐藥(P<0.01)。

10、>　　 4.細胞周期檢測顯示，耐藥細胞G2/M和S期所占比例較親本細胞增加，G1期所占比例減少，兩組相比差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。
　　 5.免疫熒光染色及Western blot檢測顯示：隨著耐藥指數(shù)增加，hTERT逐漸從細胞核轉(zhuǎn)位到線粒體(P<0.05)。
　　 6.適時熒光定量PCR顯示：隨著耐藥指數(shù)增加，耐藥細胞端粒長度縮短；線粒體DNA損傷降低(P<0.01)。
　　 7.耐藥細胞的線粒體膜

11、電位下降(P<0.05)。
　　 8.細胞凋亡率檢測顯示，耐藥細胞SK-Hepl/CDDP1、SK-Hepl/CDDP2和SK-Hepl/CDDP3的凋亡率較親本細胞下降(P<0.01)。
　　 結(jié)論：
　　 1.成功地建立不同耐藥程度的人肝癌多藥耐藥細胞SK-Hepl/CDDP1、SK-Hepl/CDDP2和SK-Hepl/CDDP3。
　　 2.當腫瘤細胞接觸化療藥物后，端粒酶可能從細胞核內(nèi)移位到線粒