茶黃素固定化酶生物合成及其穩(wěn)定性研究.pdf

1、針對目前茶黃素生產(chǎn)中萃取法效率太低、化學(xué)氧化會產(chǎn)生大量的工業(yè)廢水、游離酶促反應(yīng)法不能連續(xù)化生產(chǎn)、以及近年來本研究課題組采用固定化酶法獲得茶黃素的研究還未開展的工作，本論文研究了固定化多酚氧化酶催化茶多酚生成茶黃素的包埋材料、底物兒茶素在包埋材料中的通透性、反應(yīng)溶劑系統(tǒng)以及生物合成產(chǎn)物茶黃素的穩(wěn)定性。以下是各部分工作的主要結(jié)果。 第一章首先介紹了近十年來茶黃素的生物學(xué)活性研究和制備方法，多酚氧化酶的研究進(jìn)展和固定化酶應(yīng)用現(xiàn)狀。

2、 第二章通過固定化載體的通透性分析篩選到了較為理想的固定化材料——海藻酸鈉。20.5h內(nèi)海藻酸鈉包埋的兒茶素在磷酸緩沖液體系中濃度變化范圍為19.6～7.5mg/ml，而殼聚糖為17.7～15.5mg/ml；各兒茶素組分在兩種載體中的通透性也不一樣，四種非酯型兒茶素(GC、EGC、C和EC)在海藻酸鈉和殼聚糖中通透性的差異要明顯大于四種酯型兒茶素(EGCG、GCG、ECG和CG)。 第三章對固定化酶的固定化參數(shù)和固定化多酚氧

3、化酶生化特性進(jìn)行研究。采用正交設(shè)計方法確定了固定化多酚氧化酶的最佳參數(shù)為酶液與海藻酸鈉比率1：1，戊二醛濃度0.25％、CaCl<,2>濃度2％；金屬離子對酶催化反應(yīng)影響試驗顯示，在0.1mMCu<'2+>存在時，游離多酚氧化酶活力比原有水平的增加了23.4％，但高于0.1mM濃度的Cu<'2+>則呈現(xiàn)抑制游離性多酚氧化酶的活性。Al<'3+>在整個反應(yīng)過程中對游離多酚氧化酶活性起抑制性作用。測定了IPO動力學(xué)常數(shù)K<,m>和V<,ma

4、x>值分別為3.0 mg/ml 與84.2 mg/ml。此外，不同溶劑對酶催化能力有很大影響。對水相與正己烷、氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、乙腈、乙醇、正丁醇、丙酮、甲醇和甲苯這十種有機(jī)溶劑進(jìn)行比較，水相系統(tǒng)下獲得茶黃素總量最高，達(dá)0.6 mg/ml，因此，選用水相作為溶劑反應(yīng)系統(tǒng)。 第四章探討了固定化PPO酶的穩(wěn)定性。對酶催化能力的穩(wěn)定性進(jìn)行了研究，固定化酶PPO經(jīng)過80次的重復(fù)使用，酶活依然保持原有水平的80.1％。在0.1 M

5、檸檬酸緩沖液(pH 5.6，4℃)貯存80天后，酶活為原有水平的72.9％。 第五章研究茶黃素的穩(wěn)定性。不同pH對茶黃素穩(wěn)定性的影響研究結(jié)果表明，茶黃素在pH為2．2～5．6的范圍內(nèi)，其穩(wěn)定性要高于pH值為6.5～8.0。在相同的pH條件下，不同茶黃素單體隨時間的變化不同。在pH2.2～5.6的檸檬酸緩沖溶液中各茶黃素單體穩(wěn)定性為 TF<,1>，TF<,2>A，TF<,2>B>TF<,3>，前三種組分之間差異不大，然而在pH值為