含噻唑烷-4-酮的免疫調(diào)節(jié)劑對巨噬細(xì)胞和NK細(xì)胞作用機(jī)制研究.pdf

1、目的：研究含噻唑烷-4-酮的糖類衍生小分子免疫調(diào)節(jié)劑（CH1a、CH2a、CH1b和CH2b）對固有免疫中MФ及NK細(xì)胞功能的影響；并探討MФ及NK細(xì)胞活化可能的信號通路。
　　方法：
　　①觀察免疫調(diào)節(jié)劑在體外對巨噬細(xì)胞功能的影響，實(shí)驗(yàn)以無支原體感染的RAW264.7巨噬細(xì)胞系為研究對象。首先，利用CyQuant Cell Proliferation Assay觀察免疫調(diào)節(jié)劑對LPS處理的RAW264.7巨噬細(xì)胞增殖的影響

2、；其次，經(jīng)免疫調(diào)節(jié)劑刺激的巨噬細(xì)胞吞噬FITC標(biāo)記的Fluoresbrite YG polystyrene latex beads(0.75-mm Microspheres)檢測其吞噬活性；再次，利用ELISA和RT-PCR方法分別測定培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子水平（IL-6、IL-8和TNF-α）和細(xì)胞內(nèi)mRNA（IL-6、IL-8和TNF-α）轉(zhuǎn)錄水平；此外，應(yīng)用Griess Reagent System和流式細(xì)胞技術(shù)（FACS）分別對NO

3、和活性氧（ROS）進(jìn)行了測定，并利用Western blot檢測iNOS的表達(dá)水平；最后，利用Western blot分別檢測NF-κBp65和p38MAPK兩條信號通路活化狀態(tài)。
　?、谟^察免疫調(diào)節(jié)劑對NK細(xì)胞功能的影響，利用磁珠標(biāo)記法（MACS）從健康人外周血中分離純化NK細(xì)胞并對其純度及活度進(jìn)行測定。首先，CyQuant Cell Proliferation Assay檢測免疫調(diào)節(jié)劑對正常和IL-15處理的NK細(xì)胞增殖的影響

4、；其次，51Cr-release assay測定NK細(xì)胞殺傷活性；再次，ELISA檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN-γ和TNF-α的含量；最后，Western blot檢測NK細(xì)胞殺傷相關(guān)的ERK1/2信號通路的活化狀態(tài)。
　　結(jié)果：
　　1、與對照組及CH2a和CH1b相比，CH1a和CH2b可顯著促進(jìn)LPS活化的RAW264.7的增殖，且可顯著提高巨噬細(xì)胞的吞噬活性并顯著促進(jìn)IL-6、IL-8和TNF-α的分泌及其mRNA的轉(zhuǎn)錄

5、；提高NO和ROS的水平；促進(jìn)IκB-α降解和NF-κBp65在核內(nèi)的轉(zhuǎn)位，并促進(jìn)p38MAPK磷酸化。但是，未經(jīng)LPS活化的巨噬細(xì)胞經(jīng)CH1a、CH2a、CH1b或CH2b直接刺激后上述結(jié)果均不明顯。
　　2、CH1a、CH2a、CH1b和CH2b對正常和IL-15預(yù)處理的NK細(xì)胞無促進(jìn)增殖效應(yīng)；CH1b和CH2b可顯著提高IFN-γ與TNF-α的分泌，并能明顯促進(jìn)ERK1/2的磷酸化，而這種效應(yīng)經(jīng)PD098059阻斷后消失。<