γδT細(xì)胞對肺巨噬細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用的研究.pdf

1、第一部分：
　　 T淋巴細(xì)胞表面表達(dá)兩種抗原受體(TCR)即αβ TCR和γδ FCR。人們目前研究較多的是αβ T細(xì)胞,γδ T細(xì)胞所占比例較小,僅占正常人外周血淋巴細(xì)胞總數(shù)的3％～10％,但是在機(jī)體免疫調(diào)節(jié)及免疫監(jiān)視中起著重要的作用。γδT細(xì)胞主要識別以下類型的抗原:MHC分子；磷酸化抗原；熱休克蛋白；非肽類抗原等。本文首先利用三種不同的抗原(即IPP,HSP70和EP6)刺激小鼠脾臟γδ T細(xì)胞,以了解三種抗原在不同濃度和

2、不同方式干預(yù)下小鼠脾臟γδ T細(xì)胞的增殖純度。
　　 實(shí)驗(yàn)中主要采用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞培養(yǎng)中脾臟γδ T細(xì)胞的比例。結(jié)果表明,在IPP,HSP70和EP6持續(xù)刺激下脾臟γδ T細(xì)胞在培養(yǎng)第三天時均出現(xiàn)增殖的高峰,而后增殖有所下降。隨著三種抗原濃度的增加,IPP的濃度在1.25ng/ml時出現(xiàn)脾臟γδT細(xì)胞的增殖高峰,擴(kuò)殖的百分比為5.45％±0.02％(P<0.05)；而后隨著濃度的增加增殖減低。在相同濃度下不同干預(yù)方式中發(fā)現(xiàn),

3、三種抗原一次性單次刺激時亦均在作用后第三天出現(xiàn)增殖高峰,擴(kuò)增的百分比分別為3.60％±0.27％,4.64％±0.16％,3.20％±0.11％(P<0.05)；IPP和EP6組第三天增殖高峰時,持續(xù)性刺激的增殖純度大于一次性單次刺激,擴(kuò)增的百分比分別為(6.38％±0.58％ VS3.60％±0.27％,5.41％±0.11％ VS3.20％±0.11％)(P<0.05)。
　　 本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了在體外刺激脾臟γδT細(xì)胞時,增殖高

4、峰出現(xiàn)在培養(yǎng)的第三天。不同抗原刺激的γδT細(xì)胞種類不同,因而增殖的純度亦不相同。持續(xù)性的抗原刺激較一次性單次刺激更能促進(jìn)γδT細(xì)胞的增殖。
　　 第二部分：
　　 γδ T細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用越來越受研究者的重視,已知另一種在免疫反應(yīng)中起重要作用的巨噬細(xì)胞廣泛分布于全身各組織中,是機(jī)體抵抗外界入侵的重要防線。雷帕霉素是一種大環(huán)內(nèi)酯類免疫抑制劑,已知的主要靶點(diǎn)是胞漿內(nèi)的激酶mTOR。通過體外培養(yǎng)LPS誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷模型

5、中脾臟γδ T細(xì)胞和肺組織巨噬細(xì)胞,以了解脾臟γδT細(xì)胞和肺組織巨噬細(xì)胞之間是否存在相互作用以及體外雷帕霉素對這種相互作用是否有影響。
　　 實(shí)驗(yàn)中,建立LPS誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷的模型,采用HE染色固定肺組織并觀察其病理改變；流式細(xì)胞術(shù)檢測磁珠分選前后肺組織巨噬細(xì)胞和脾臟γδ T細(xì)胞的純度,熒光顯微鏡下觀察脾臟γδT細(xì)胞的形態(tài),ELISA法檢測小鼠脾臟γδT細(xì)胞和肺組織巨噬細(xì)胞培養(yǎng)的上清液中炎癥因子IL-4,IL-12,IFN

6、—γ和TNF—α的分泌水平； Real—time PCR檢測培養(yǎng)細(xì)胞中IL-4,IL—12,IFN—γ和TNF—α的mRNA水平。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷模型中,LPS組支氣管肺泡灌洗液的總細(xì)胞和中性粒細(xì)胞濃度明顯大于PBS組和LPS+RAPA組,總細(xì)胞分別為(85.6±31.2VS10.8±2.5,48.6±26.0)×104個/ml,中性粒細(xì)胞的分別為(73.4±28.8 VS1.5±0.5,39.8±2

7、4.8)×104個/ml(P<0.05)。脾臟γδT細(xì)胞與肺組織巨噬細(xì)胞按1:1混合培養(yǎng)時,LPS組上清液IFN—γ高于PBS組,PAPA組和LPS+RAPA組(174.17±42.16 VS16.80±8.80,12.19±4.14,7.16±3.03)pg/ml,(P<0.05)。IL～4高于PBS組和LPS+RAPA組(73.82±61.71 VS19.19±10.01,12.35±1.86)pg/ml,(P<0.05)。而TNF

8、—α只高于PAPA組和LPS+RAPA組(34.24±8.08 VS12.20±4.56,10.56±2.99)pg/ml,(P<0.05).混合培養(yǎng)時LPS組IFN—γ mRNA的表達(dá)明顯高于PBS組(10.67±4.62 VS1),(P<0.05)。
　　 本研究中體外將脾臟γδT細(xì)胞和肺組織巨噬細(xì)胞分離純化后進(jìn)行培養(yǎng),使得細(xì)胞生長的內(nèi)環(huán)境受外界干擾較少,較真實(shí)的反映細(xì)胞的生物學(xué)活性。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中RAPA能抑制

9、LPS誘導(dǎo)小鼠急性肺損傷的支氣管肺泡灌洗液中總細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的增殖,體外實(shí)驗(yàn)中顯示了脾臟γδ T細(xì)胞和肺組織巨噬細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)時未見明顯的變化,但混合培養(yǎng)時細(xì)胞因子分泌產(chǎn)生很大變化,說明脾臟γδ T細(xì)胞和肺組織巨噬細(xì)胞可能存在細(xì)胞間的相互作用從而影響了各自的生物學(xué)活性。在混合培養(yǎng)時,LPS能刺激脾臟γδ T細(xì)胞和肺組織巨噬細(xì)胞分泌較多的IFN—γ和IL-4,并能增加混合培養(yǎng)細(xì)胞中IFN—γ mRNA的表達(dá)。RAPA能抑制混合培養(yǎng)分泌的I