松花粉硫酸酯化多糖對小鼠巨噬細胞的免疫調(diào)節(jié)作用.pdf

1、本實驗室先前采用馬尾松花粉粗多糖硫酸酯化多糖（SPPM60）作用與小鼠脾臟混懸細胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SPPM60能顯著促進脾臟混懸細胞內(nèi)自由鈣離子濃度的升高。由于脾臟淋巴細胞中富含T、B淋巴細胞，為了進一步探究松花粉多糖及其酯化多糖對于脾臟淋巴細胞具體作用機制，本實驗室分別從脾臟中分離出了T、B淋巴細胞研究了松花粉多糖及其酯化多糖對其免疫調(diào)節(jié)作用，實驗證實了馬尾松花粉酯化多糖對于T、B淋巴細胞都具有顯著的激活作用，均促進了T淋巴細胞和B淋巴細胞

2、的增殖以及T淋巴細胞B淋巴細胞胞內(nèi)鈣離子濃度的升高。同時還通過實驗驗證了其中一條SPPM60作用于淋巴細胞引起胞內(nèi)鈣離子濃度升高的可能的胞內(nèi)鈣離子信號通路：SPPM60→Receptor→PI3K→PLC→IP3→IP3R→CRAC，其中Toll樣受體4是硫酸酯化多糖作用于B淋巴細胞的主要多糖受體。
　　一、采用熱水浸提提取松花粉粗多糖，進一步用三氯乙酸法除去其中的蛋白質(zhì)成分以后再分別用20％、40%、60%、80%的乙醇對粗多糖

3、組分進行依次沉淀。選取60%乙醇沉淀的多糖組分經(jīng)過聚丙烯酰胺凝膠柱層析對其進行分離純化，直至最終得到一種較均一的組分，將其命名為PPM60-D。稱取14.87mg PPM60-D，采用氯磺酸-吡啶法對其進行硫酸酯化，最終得到硫酸酯化多糖SPPM60-D18.57mg，氯化鋇-明膠比濁法測定硫酸酯化多糖的取代度為1.87。紅外光譜分析硫酸酯化多糖中有S=O和C-O-S的特征吸收峰，表明PPM60-D硫酸酯化成功。
　　二、采用腹腔灌

4、洗法提取小鼠腹腔巨噬細胞，用MTT法檢測PPM60-D和SPPM60-D在不同作用濃度下對小鼠腹腔巨噬細胞相對活性的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)800μg/mL的SPPM60-D能明顯增強小鼠腹腔巨噬細胞的相對活性，而PPM60-D對小鼠腹腔巨噬細胞的作用相對較弱。用MTT法檢測PPM60-D和SPPM60-D在不同濃度下對小鼠巨噬細胞RAW264.7增殖能力的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)800μg/mL的SPPM60-D能顯著增強小鼠巨噬細胞RAW264.7的增

5、殖能力，而PPM60-D對小鼠巨噬細胞RAW264.7的促增殖作用效果相對較弱。
　　三、用雙波長熒光分光光度計檢測800μg/mL SPPM60-D處理的巨噬細胞RAW264.7后[Ca2+]i的變化情況。800μg/mL SPPM60-D顯著的提高了巨噬細胞RAW264.7胞內(nèi)自由鈣離子濃度。采用抑制劑處理鈣離子通路中的幾個關(guān)鍵蛋白后發(fā)現(xiàn)2-APB、U73122和TAK-242較大程度地抑制SPPM60-D引起的巨噬細胞RAW

6、264.7胞內(nèi)自由鈣離子濃度的升高，LY294002和Verapamil能部分抑制SPPM60-D引起的巨噬細胞RAW264.7胞內(nèi)自由鈣離子濃度的升高，低分子肝素鈉可以完全抑制SPPM60-D所引起的巨噬細胞RAW264.7胞內(nèi)自由鈣離子濃度的升高，并且會使其低于空白對照組胞內(nèi)自由鈣離子濃度。
　　四、通過檢測小鼠巨噬細胞粘附遷移能力、吞噬能力、分泌的主要的細胞因子（TNF?α、IL-1、IL-6）及重要炎癥介質(zhì)（NO、NO合酶

7、）的情況來探究PPM60-D及SPPM60-D對巨噬細胞的免疫調(diào)節(jié)能力。同時結(jié)合小鼠巨噬細胞表面的主要多糖受體TLR4的抑制劑（TAK-242），探究Toll樣受體4（TLR4）在多糖作用于巨噬細胞中的作用。實驗結(jié)果表明，SPPM60-D能顯著的促進小鼠巨噬細胞分泌重要的炎癥介質(zhì)和主要細胞因子，而且作用效果比陽性對照（LPS）要強。PPM60-D也有一定程度的促進作用但是作用效果不是很明顯。用TLR4的抑制劑TAK242作用后，發(fā)現(xiàn)明顯