糖基化終產(chǎn)物對(duì)大鼠海馬小膠質(zhì)細(xì)胞活化及炎癥因子表達(dá)的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、[研究背景]
　　 阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)是一種以進(jìn)行性認(rèn)知障礙為主要表現(xiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，是老年人癡呆最常見的病因。其主要病理三大特征為老年斑、神經(jīng)元纖維纏結(jié)和小膠質(zhì)細(xì)胞激活為中心的炎癥反應(yīng)。AD的發(fā)病機(jī)制很復(fù)雜，尚不完全清楚，近來研究發(fā)現(xiàn)阿爾茨海默病不同發(fā)病環(huán)節(jié)，即異常神經(jīng)遞質(zhì)含量、過多的中樞神經(jīng)系統(tǒng)氨基酸含量、過強(qiáng)的免疫炎癥反應(yīng)、細(xì)胞因子過度表達(dá)、淀粉樣β蛋白沉積和tau蛋白異常磷酸

2、化、神經(jīng)元代謝異常、自由基產(chǎn)生和氧化應(yīng)激損傷等和被激活的小膠質(zhì)細(xì)胞有聯(lián)系。目前認(rèn)為神經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞的活化引起腦內(nèi)慢性炎癥反應(yīng)可能是AD發(fā)病的核心病理機(jī)制之一。糖基化終產(chǎn)物(advanced glycation end products，AGE)是還原糖與蛋白質(zhì)的氨基通過一系列復(fù)雜的非酶促反應(yīng)形成的結(jié)構(gòu)多樣的不可逆聚合物。已有研究發(fā)現(xiàn)AGE可以通過對(duì)老年斑進(jìn)行修飾，激活鄰近的小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞導(dǎo)致氧化應(yīng)激和產(chǎn)生炎性細(xì)胞分子誘發(fā)AD早期

3、的炎癥反應(yīng)。但AGE是否直接激活小膠質(zhì)細(xì)胞引起炎性反應(yīng)尚未見報(bào)道。因此，本研究在體內(nèi)、體外水平上探討AGE是否直接或通過作用細(xì)胞表面的受體誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞活化及炎癥因子的高表達(dá)。
　　 [目的]
　　 1.體內(nèi)水平研究糖基化終產(chǎn)物對(duì)大鼠海馬小膠質(zhì)細(xì)胞活化及TNF-α、IL-1β、COX-2、p-NF-κB表達(dá)的影響。
　　 2.體外水平研究糖基化終產(chǎn)物對(duì)原代培養(yǎng)的小膠質(zhì)細(xì)胞活化及分泌TNF-α、IL-1β、COX-

4、2、NO的影響。
　　 3.探討糖基化終產(chǎn)物誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞激活引起的炎癥反應(yīng)在AD病理變化中的作用。
　　 [研究方法]
　　 30只Wistar大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組(control組)、BSA組、AGE-BSA組、AGE/RAGE-Ab組及RAGE-Ab組，每組6只。通過向大鼠海馬區(qū)注射AGE-BSA，建立AD大鼠局部炎癥病理模型。3周后采用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)大鼠認(rèn)知行為學(xué)改變，免疫熒光組織化學(xué)法觀察

5、海馬組織小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物(CD11b)、星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)表達(dá)的變化；免疫組織化學(xué)法及蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測(cè)各組海馬組織TNF-α、IL-1β、COX-2及p-NF-κB的蛋白表達(dá)。
　　 體外培養(yǎng)小膠質(zhì)細(xì)胞，用AGE-BSA干預(yù)，用免疫細(xì)胞化學(xué)方法進(jìn)行鑒定并觀察其形態(tài)變化；用300μg/mL AGE-BSA激活和抗RAGE中和抗體阻斷的方法對(duì)原代培養(yǎng)的小膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行處理，經(jīng)酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)

6、動(dòng)態(tài)檢測(cè)細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-1β、COX-2及NO的水平。
　　 [研究結(jié)果]
　　 1.大鼠海馬區(qū)注射AGE-BSA建立模型，與control組比較，AGE-BSA組大鼠逃避潛伏期明顯延長，提示大鼠認(rèn)知功能下降，免疫熒光組織化學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)海馬區(qū)可見神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞增生，以小膠質(zhì)細(xì)胞為主；TNF-α、IL-1β、COX-2及p-NF-κB的表達(dá)明顯增高(P<0.001)；AGE/RAGE-Ab組海馬區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞增生較

7、AGE-BSA組明顯減弱，TNF-α、IL-1β、COX-2及p-NF-κB表達(dá)也明顯下調(diào)(P<0.01)，但仍高于NC組；NC組、BSA組、RAGE-Ab組TNF-α、IL-1β、COX-2及p-NF-κB表達(dá)差異不顯著(P>0.05)。
　　 2.原代培養(yǎng)的小膠質(zhì)細(xì)胞經(jīng)AGE-BSA干預(yù)后小膠質(zhì)細(xì)胞胞體變大，形態(tài)不規(guī)則，呈“阿米巴樣”，細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-1β、COX-2及NO濃度均明顯升高(P<0.001)，AG

8、E/RAGE-Ab組細(xì)胞上清液TNF-α、IL-1β、COX-2及NO濃度較AGE-BSA組呈明顯下降趨勢(shì)(P<0.01)，但仍高于control組(P<0.01)。
　　 [結(jié)論]
　　 1.大鼠海馬區(qū)注射AGE-BSA可誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞增殖、活化，促進(jìn)TNF-α、IL-1β、COX-2及p-NF-κB的蛋白表達(dá)增強(qiáng)。
　　 2.AGE-BSA可激活小膠質(zhì)細(xì)胞，誘導(dǎo)其釋放TNF-αIL-1β、COX-2及NO，并

9、呈時(shí)間依賴性。
　　 3.AGE-BSA可直接或通過作用其受體(RAGE)激活小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)一系列免疫炎性反應(yīng)，小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)釋放炎癥介質(zhì)介導(dǎo)神經(jīng)毒性作用的發(fā)生，可損傷神經(jīng)元，AGE可能參與AD發(fā)生的病理機(jī)制之一。
　　 [意義]
　　 本研究表明AGE-BSA可直接或通過作用細(xì)胞表面的RAGE激活小膠質(zhì)細(xì)胞，促進(jìn)大量炎癥因子的表達(dá)，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)。提示AGE誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞激活引起的炎癥反應(yīng)可能參與AD的病理改