基于量子點(diǎn)熒光探針的大腸癌成像研究.pdf

1、目的：
　　大腸癌是常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，在我國(guó)，該病的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)。早診斷、早治療是提高大腸癌治愈率的關(guān)鍵。目前，我國(guó)常用大腸癌診斷方法在靈敏度、特異性和陽(yáng)性檢出率上都有不盡如人意之處，因此，建立一種無(wú)創(chuàng)性、靈敏度高、特異性強(qiáng)的大腸癌檢測(cè)技術(shù)對(duì)提高該病的治愈率具有重要的意義。
　　量子點(diǎn)—這種新型的熒光染料正在引起人們?cè)絹?lái)越多的關(guān)注。量子點(diǎn)(Quantum dots，QDs)是指直徑為1-10nm的半導(dǎo)體納米顆粒，一

2、般是由Ⅱ-Ⅵ族（如CdSe、CdTe、CdS、ZnSe等）或Ⅲ-Ⅴ族（如InP、InAs等）元素組成。量子點(diǎn)獨(dú)特的量子尺寸效應(yīng)和表面效應(yīng)使其具有良好的光學(xué)特性，因而，成為新型的熒光標(biāo)記物。與傳統(tǒng)的有機(jī)熒光染料相比，量子點(diǎn)具有以下光學(xué)特性:(1)量子點(diǎn)的激發(fā)光譜寬且連續(xù)分布，發(fā)射光譜窄且對(duì)稱(chēng)，因此不同的量子點(diǎn)可以實(shí)現(xiàn)一元激發(fā)，多色成像;(2)通過(guò)改變量子點(diǎn)的化學(xué)組成或粒徑大小可改變它的發(fā)射波長(zhǎng)，在多色成像時(shí)，提高了檢測(cè)的“信噪比”，增加了

3、靈敏度。另外，選用發(fā)射波長(zhǎng)位于紅外區(qū)的量子點(diǎn)，其產(chǎn)生的“紅光”在組織內(nèi)的穿透力強(qiáng)，更適合在活體動(dòng)物內(nèi)進(jìn)行深層組織的成像研究;(3)量子點(diǎn)的Stocks位移大，可避免激發(fā)光的干擾，提高了檢測(cè)的靈敏度;(4)量子點(diǎn)的熒光強(qiáng)度高，是普通有機(jī)熒光染料的10-20倍，因而檢測(cè)的靈敏度高;(5)量子點(diǎn)的抗光漂白能力強(qiáng)，適合進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)、動(dòng)態(tài)的生命過(guò)程的研究。
　　量子點(diǎn)經(jīng)表面修飾后，可以與抗體分子偶聯(lián)，制備出新型的免疫熒光探針。該熒光探針，即保留

4、了量子點(diǎn)獨(dú)特的光學(xué)特性，同時(shí)義具有抗體分子識(shí)別抗原的特異性，因而提高了檢測(cè)的特異性和靈敏度，這對(duì)建立新型的腫瘤檢測(cè)技術(shù)具有重要的意義。
　　LEA(large external antigen)即大腸癌相關(guān)抗原，是位于大腸癌細(xì)胞表面的一種腫瘤標(biāo)志物。據(jù)研究表明，LEA具有較強(qiáng)的組織特異性。ND-1是通過(guò)雜交瘤技術(shù)制備的抗LEA的單克隆抗抗體;ND-1-scFv是通過(guò)基因工程技術(shù)制備的ND-1單鏈抗體ND-1-scFv。同完整抗體N

5、D-1相比，ND-1-scFv具有許多優(yōu)點(diǎn):(1)分子量小，免疫原性低，用于人體不易產(chǎn)生抗異種蛋白反應(yīng);(2)容易進(jìn)入實(shí)體瘤周?chē)奈⒀h(huán);(3)血循環(huán)和全身廓清快，半衰期短，腎臟蓄積很少;(4)無(wú)Fc段，不易與具有Fc受體的非靶細(xì)胞結(jié)合，成像清晰;(5)易于基因操作和基因工程大量生產(chǎn)。由于scFv的這些優(yōu)點(diǎn)，使得其在腫瘤臨床診斷和治療中顯示了巨大的潛力。
　　適配子是通過(guò)SELEX(即指數(shù)富集的配基系統(tǒng)進(jìn)化，Systematic

6、Evolution ofLigands by Exponential Enrichment，SELEX)技術(shù)制備的單鏈寡聚核苷酸。通過(guò)這種方式篩選到的適配子可以特異性地識(shí)別靶標(biāo)分子，并通過(guò)其獨(dú)特的二級(jí)或三級(jí)結(jié)構(gòu)與之結(jié)合，因而我們又把適配子稱(chēng)為“人工抗體”。與抗體蛋白相比，適配子具有一定的優(yōu)勢(shì)。(1)適配子可以體外合成，節(jié)約時(shí)間和成本;(2)適配子對(duì)熱、各種有機(jī)試劑及各種pH更穩(wěn)定;(3)適配子的靶標(biāo)范圍比抗體蛋白更廣泛，從小分子毒素、無(wú)

7、機(jī)離子到蛋白質(zhì)、整個(gè)細(xì)胞甚至組織;(4)由于適配子通過(guò)體外合成，免疫原性低，可以實(shí)現(xiàn)更高效、更安全的體內(nèi)靶向標(biāo)記和治療。正是適配子的這些優(yōu)點(diǎn)，使其在腫瘤診斷和治療中有著越來(lái)越多的應(yīng)用。
　　本研究分別采用EDC和NHS介導(dǎo)的共價(jià)偶聯(lián)法和生物素—鏈霉親和素介導(dǎo)的非共價(jià)偶聯(lián)法將量子點(diǎn)QDs與單克隆抗體ND-1、單鏈抗體ND-1-scFv偶聯(lián)，成功制備檢測(cè)大腸癌細(xì)胞相關(guān)抗原LEA的特異性熒光探針，實(shí)現(xiàn)對(duì)大腸癌細(xì)胞、病理組織高靈敏度檢測(cè);

8、進(jìn)一步的荷瘤裸鼠體內(nèi)靶向標(biāo)記研究結(jié)果表明單鏈抗體量子點(diǎn)探針在動(dòng)物體內(nèi)也具有較高的標(biāo)記特異性;以EDC和NHS為共價(jià)偶聯(lián)劑，制備適配子BC15-QD熒光探針，實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞和病理組織表達(dá)的靶標(biāo)蛋白的特異性標(biāo)記。本研究可望為大腸癌早期診斷提供新的檢測(cè)技術(shù)。
　　方法：
　　一、單克隆抗體(ND-1)量子點(diǎn)探針的制備及對(duì)大腸癌相關(guān)抗原LEA的特異性檢測(cè)
　?。ㄒ唬┥锼亟閷?dǎo)的單克隆抗體ND-1量子點(diǎn)探針的制備及對(duì)LEA的特異性檢

9、測(cè)
　　經(jīng)雜交瘤技術(shù)制備、純化單克隆抗體ND-1;并與生物素反應(yīng)，制備生物素化的ND-1(ND-1-Biotin)。通過(guò)生物素—鏈霉親和素的特異性結(jié)合，將生物素化的單克隆抗體ND-1與鏈霉親和素標(biāo)記的量子點(diǎn)(SA-QD)非共價(jià)偶聯(lián)，利用免疫熒光成像技術(shù)，考察SA-QD探針對(duì)高表達(dá)LEA的大腸癌細(xì)胞系CCL187靶向標(biāo)記能力。通過(guò)單克隆抗體ND-1與ND-1-Biotin的免疫競(jìng)爭(zhēng)標(biāo)記實(shí)驗(yàn)，利用LSCM檢測(cè)熒光強(qiáng)度的變化，進(jìn)一步考察

10、SA-QD探針對(duì)LEA的標(biāo)記特異性。
　　利用免疫熒光標(biāo)記技術(shù)，將QD-SA探針?lè)謩e與大腸癌細(xì)胞系CCL187、HT29和CloneA孵育，利用熒光顯微鏡下觀察量子點(diǎn)熒光信號(hào);進(jìn)一步利用FCM對(duì)量子點(diǎn)標(biāo)記后的三種細(xì)胞的熒光強(qiáng)度進(jìn)行定量分析，以考察ND-1-Biotin、SA-QD在細(xì)胞水平上對(duì)LEA表達(dá)水平的定性、定量檢測(cè)。
　　通過(guò)免疫熒光組化技術(shù)對(duì)53例分化程度不同的大腸癌病理組織切片進(jìn)行檢測(cè)，考察ND-1-Biotin

11、、SA-QD對(duì)病理組織表達(dá)的LEA靶向標(biāo)記的能力。
　?。ǘ〦DC和NHS介導(dǎo)的ND-1量子點(diǎn)探針（ND-1-QD）的制備及對(duì)LEA的特異性檢測(cè)
　　量子點(diǎn)經(jīng)EDC和NHS活化后，與一定濃度的抗體蛋白共價(jià)反應(yīng)實(shí)現(xiàn)偶聯(lián)。本實(shí)驗(yàn)對(duì)量子點(diǎn)與抗體蛋白反應(yīng)的摩爾比例（1∶20、1∶40和1∶80）進(jìn)行了考察，利用瓊脂糖電泳對(duì)偶聯(lián)效果進(jìn)行檢測(cè)，優(yōu)化共價(jià)偶聯(lián)條件。
　　利用免疫熒光細(xì)胞技術(shù)，考察ND-1-QD對(duì)靶細(xì)胞特異性標(biāo)記的能

12、力。
　　二、單鏈抗體(ND-1-scFv)量子點(diǎn)探針的制備及對(duì)大腸癌相關(guān)抗原LEA的特異性檢測(cè)
　　通過(guò)基因工程技術(shù)，制備完整抗體ND-1的單鏈抗體ND-1-scFv，利用SDS-PAGE電泳鑒定抗體的純度;利用免疫熒光技術(shù)考察抗體的免疫結(jié)合活性。
　　結(jié)果：
　　一、單克隆抗體(ND-1)量子點(diǎn)探針的制備及對(duì)大腸癌相關(guān)抗原LEA的特異性檢測(cè)
　　純化后單克隆抗體ND-1與生物素反應(yīng)后，制備生物素化抗體N

13、D-1-Biotin。
　　經(jīng)免疫熒光技術(shù)檢測(cè)，在靶細(xì)胞CCL187細(xì)胞膜上顯示清晰的紅色熒光，背景及細(xì)胞質(zhì)、核內(nèi)無(wú)非特異性信號(hào);在免疫競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)中，在LSCM下觀察到隨競(jìng)爭(zhēng)性ND-1的濃度增加，量子點(diǎn)的熒光強(qiáng)度逐漸減弱;LSCM半定量分析與觀察到的結(jié)果一致。這說(shuō)明ND-1-Biotin、SA-QD能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)LEA的特異性檢測(cè)。
　　對(duì)53例分化程度不同的大腸癌病理切片免疫組化檢測(cè)結(jié)果顯示，ND-1-Biotin、SA-QD能

14、夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)組織切片表達(dá)的LEA的特異性檢測(cè);同其他研究者采用的免疫組化技術(shù)檢測(cè)結(jié)果相比，基于量子點(diǎn)的免疫熒光組化技術(shù)陽(yáng)性檢測(cè)率略有提高;對(duì)檢測(cè)結(jié)果分析表明，量子點(diǎn)標(biāo)記的熒光信號(hào)的強(qiáng)弱與分化程度有關(guān)，而相關(guān)研究表明LEA的表達(dá)水平與分化程度相關(guān)，提示可以利用該技術(shù)通過(guò)對(duì)LEA的標(biāo)記，進(jìn)行病理診斷的定量檢測(cè)。
　?。ǘ〦DC和NHS介導(dǎo)的量子點(diǎn)探針（ND-1-QD）的制備及對(duì)LEA的特異性檢測(cè)
　　通過(guò)瓊脂糖電泳對(duì)偶聯(lián)產(chǎn)物電泳遷

15、移率的比較，結(jié)果顯示，當(dāng)量子點(diǎn)與抗體摩爾比為1∶40時(shí)，二者能夠有效偶聯(lián)，選擇該條件進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　利用熒光分光光度計(jì)對(duì)偶聯(lián)產(chǎn)物的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜進(jìn)行掃描，結(jié)果顯示量子點(diǎn)偶聯(lián)產(chǎn)物的譜峰位置與游離量子點(diǎn)一致，即仍然保持原有的熒光特性。
　　ND-1-QD偶聯(lián)產(chǎn)物被激發(fā)光源持續(xù)照射1h后，熒光強(qiáng)度幾乎沒(méi)有發(fā)生變化，這說(shuō)明與蛋白偶聯(lián)后，量子點(diǎn)仍具有很強(qiáng)的抗漂白能力。
　　將ND-1-QD與LEA高表達(dá)的靶細(xì)胞CCL18

16、7孵育后，熒光顯微鏡觀察可見(jiàn)細(xì)胞膜上清晰的紅色熒光，細(xì)胞內(nèi)及背景上無(wú)非特異性熒光，這說(shuō)明共價(jià)偶聯(lián)法制備的ND-1-QD能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)LEA的特異性檢測(cè)。
　　二、單鏈抗體(ND-1-scFv)量子點(diǎn)探針的制備及對(duì)大腸癌相關(guān)抗原LEA的特異性檢測(cè)
　　利用基因工程技術(shù)制備N(xiāo)D-1的單鏈抗體ND-1-scFv，經(jīng)SDS-PAGE電泳灰度掃描顯示抗體的純度高達(dá)95％，經(jīng)間接免疫熒光技術(shù)顯示該單鏈抗體具有較強(qiáng)的免疫結(jié)合活性。
　　

17、免疫熒光技術(shù)顯示，當(dāng)量子點(diǎn)與單鏈抗體的摩爾比為1∶50時(shí)，偶聯(lián)反應(yīng)較為充分，背景及細(xì)胞內(nèi)無(wú)非特異性信號(hào)。
　　熒光分光光度計(jì)掃描偶聯(lián)產(chǎn)物的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜，與游離量子點(diǎn)比較，結(jié)果顯示與蛋白偶聯(lián)后，量子點(diǎn)的激發(fā)譜線(xiàn)和發(fā)射譜線(xiàn)幾乎沒(méi)有改變，峰高略有增加。
　　結(jié)論：
　　1、本研究成功制備了抗人大腸癌單克隆抗體ND-1與單鏈抗體ND-1-scFv的量子點(diǎn)探針，并在細(xì)胞、病例組織切片、荷瘤裸鼠等不同層面上證明ND-1-QD