短尾蝮蛇毒纖溶酶原激活劑的分離純化及活性測定.pdf

1、蛇毒中含有較多的影響血液系統(tǒng)功能的活性組分，如：凝血酶樣酶、解離素、纖溶酶、纖溶酶原激活劑、凝血X因子激活劑等，特別是在蝮科和蝰科蛇毒中尤為突出。 1993年，張?jiān)剖状螐闹袢~青蛇毒中分離純化出蛇毒纖溶酶原激活劑(TSV-PA)，為從蛇毒中開發(fā)新型抗栓藥物提供新的課題，本課題旨在從江浙產(chǎn)短尾蝮(Gloydiusbrevicaudus)蛇毒中分離純化出短尾蝮蛇毒纖溶酶原激活劑(plasminogenactivatorofGloydi

2、usbrevicaudusvenomGBV-PA)，并對其理化性質(zhì)及部分生物學(xué)活性進(jìn)行研究，為尋找較好的抗血栓藥物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 1.GBV-PA的分離純化及部分理化性質(zhì)測定 1.1GBV-PA的分離純化 應(yīng)用苯甲脒-瓊脂糖凝膠(BenzamidineSepharose6B)親和層析，得到兩個蛋白峰，經(jīng)纖維蛋白平板法鑒定第Ⅱ峰有激活纖溶酶原間接溶解纖維蛋白的作用，該組分再過LichrospherC184.6/25

3、0反相色譜柱，得到純品GBV-PA。 1.2GBV-PA的理化性質(zhì) GBV-PA經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。在β-巰基乙醇還原和非還原條件下，均顯示單一條帶，即其為單一肽鏈的蛋白質(zhì)，分子量為40kDa左右。采用聚丙烯酰胺凝膠盤狀電泳測定其等電點(diǎn)(pI)為5.2。 2.GBV-PA的生物學(xué)活性測定 2.1GBV-PA的比活性 采用發(fā)色底物法(S-2390)，證明GBV-

4、PA能特異的激活人纖溶酶原為纖溶酶而降解纖維蛋白，且呈現(xiàn)一定的時效和量效關(guān)系。經(jīng)測定其比活性為2.87t-PAIU/mg。 2.2GBV-PA酶學(xué)特性測定 GBV-PA活性可被絲氨酸蛋白酶抑制劑苯甲基磺酰氟(PMSF)和苯甲脒(Benzamidine)所抑制，而不受金屬蛋白酶抑制劑EDTA-Na2影響。說明GBV-PA為絲氨酸蛋白酶，而非金屬蛋白酶。纖維蛋白結(jié)合實(shí)驗(yàn)表明GBV-PA不同于t-PA，對纖維蛋白無親和性。

5、 3.GBV-PA體內(nèi)的抗血栓作用 3.1GBV-PA對靜脈血栓的溶栓作用 采用家兔耳緣靜脈血栓模型，觀察GBV-PAiv給藥對家兔實(shí)驗(yàn)性靜脈血栓的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)GBV-PA50和100ug/kgiv對于已形成的家兔耳緣靜脈血栓，可促進(jìn)血栓消退，縮短血管再開通時間，即對動物實(shí)驗(yàn)性血栓具有治療作用。 3.2GBV-PA對動脈血栓的溶栓作用 采用家兔頸動脈內(nèi)血栓模型，觀察GBV-PAiv給藥對家兔實(shí)驗(yàn)性動

6、脈血栓的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)GBV-PA300ug/kgiv給藥后血栓重量較其他組明顯減輕(P＜0.01)，這表明GBV-PA對家兔的動脈血栓也有溶解作用。 3.3GBV-PA對血栓形成的影響 利用Chandler旋轉(zhuǎn)環(huán)進(jìn)行體外血栓形成實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)GBV-PA50、100ug/kg在給藥后3、8和24h均可明顯減少體外血栓的長度和濕重。這表明GBV-PA具有提高家兔血漿纖溶活性，促進(jìn)纖維蛋白(原)降解，產(chǎn)生防栓和溶栓作用。

7、 3.4GBV-PA對家兔血漿纖溶活性的影響 測定給藥前及給藥后3h、8h和24h家兔血漿優(yōu)球蛋白溶解時間，結(jié)果表明GBV-PA50、100ug/kg在給藥后3h、8h、24h均可明顯縮短家兔血漿優(yōu)球蛋白溶解時間(p＜0.01)，陽性對照藥尿激酶雖然可使血管再通時間縮短，但在給藥后3、8和24h對優(yōu)球蛋白溶解時間已無明顯影響。 4.GBV-PA對血小板作用研究 4.1GBV-PA對血小板聚集的影響

8、采用經(jīng)典的Born法，測定GBV-PA對ADP、凝血酶誘導(dǎo)的體外血小板聚集的影響。結(jié)果顯示，GBV-PA對ADP和凝血酶誘導(dǎo)的血小板聚集均有抑制作用，且呈明顯的量效關(guān)系。 4.2GBV-PA對小鼠急性肺栓塞的作用 采用ADP-Na2誘導(dǎo)的小鼠急性肺栓塞模型，結(jié)果表明GBV-PA150ug/kg和200ug/kgivADP-Na誘導(dǎo)的急性肺栓塞具有明顯的緩解作用，提示GBV-PA在體內(nèi)對ADP-Na誘發(fā)的血小板聚集具有抑制

9、作用。 結(jié)論：從江浙短尾蝮蛇毒中分離得到一個GBV-PA純品，分子量為40kDa左右，等電點(diǎn)為5.2。發(fā)色底物法(S-2390)法證明GBV-PA能特異的激活人纖溶酶原為纖溶酶而降解纖維蛋白，其比活性為2.87IU/mg。GBV-PA為一種絲氨酸蛋白酶，與纖維蛋白無特異性的親和力。在體外可抑制ADP和凝血酶誘導(dǎo)的血小板聚集，體內(nèi)對ADP誘導(dǎo)的急性肺栓塞綜合征有明顯的緩解作用。GBV-PA對家兔實(shí)驗(yàn)性動、靜血栓均有治療作用，同時可