短尾蝮蛇毒纖溶酶原激活劑的分離純化、抗栓作用及原核表達(dá)的研究.pdf

1、目的: 血栓性疾病，如心肌梗塞、腦梗塞和深靜脈血栓等，嚴(yán)重危害著人類的健康，溶栓治療是血栓性疾病安全而有效的治療手段。目前臨床上常用的主要有鏈激酶、尿激酶和瑞替普酶(rt-PA)等，但存在半衰期短，需反復(fù)給藥，費(fèi)用昂貴等缺點(diǎn)。因此，人們又把研究的熱點(diǎn)轉(zhuǎn)向其他來源的纖溶酶原激活劑上來，如納豆激酶(NK)、吸血蝙蝠唾液纖溶酶原激活劑(bat-PA)和蛇毒纖溶酶原激活劑等。蛇毒是多種生物活性蛋白和多肽的混合物，其中許多的組分可作用于人

2、的凝血和纖溶系統(tǒng)，特別是在蝮科和蝰科蛇毒中尤為突出。本研究旨在通過傳統(tǒng)的分離純化方法和現(xiàn)代的基因工程方法從江浙產(chǎn)短尾蝮蛇毒中獲得短尾蝮蛇毒纖溶酶原激活劑( Plasminogenactivator of Gloydius brevicaudus venom，GBV-PA)，并對(duì)其理化性質(zhì)及抗栓作用進(jìn)行初步研究，為尋找新的抗血栓藥物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法: 本研究應(yīng)用親和層析和反相高效液相色譜(RP-HPLC)兩步法分離純化

3、蛇毒纖溶酶原激活劑，纖維蛋白平板法鑒定活性。十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)鑒定蛋白質(zhì)的純度及分子量大小，聚丙烯酰胺凝膠盤狀電泳測(cè)定其等電點(diǎn)，發(fā)色底物法鑒定GBV-PA激活人纖溶酶原為纖溶酶的活性，GBV-PA與抑制劑的相互作用和纖維蛋白結(jié)合實(shí)驗(yàn)測(cè)定GBV-PA的部分理化性質(zhì)。應(yīng)用FeCl3誘導(dǎo)的大鼠頸總動(dòng)脈血栓、兔腦粉浸液誘發(fā)的大鼠下腔靜脈血栓和犬實(shí)驗(yàn)性急性腦梗塞等不同的血栓模型對(duì)蛇毒纖溶酶原激活劑的抗栓作用進(jìn)行

4、研究。采用經(jīng)典的Born法，測(cè)定GBV-PA對(duì)ADP和凝血酶誘導(dǎo)的體外血小板聚集的影響。采用ADP誘導(dǎo)的急性肺栓塞和大鼠頸動(dòng)靜脈回路血栓模型觀察GBV-PA對(duì)體內(nèi)血小板聚集的影響。利用基因工程技術(shù)，從江浙短尾蝮蛇毒中獲得GBV-PA的cDNA序列，將該基因定向克隆到原核表達(dá)載體pET42a(+)中，在大腸桿菌中表達(dá)rGBV-PA蛋白。 結(jié)果： 從江浙短尾蝮蛇毒中分離純化到分子量為32kDa左右，等電點(diǎn)為5.2的纖溶酶原激

5、活劑，命名為GBV-PA。發(fā)色底物法(S-2390)法證明GBV-PA能特異的激活人纖溶酶原為纖溶酶而降解纖維蛋白，其比活性為2.87 t-PA IU·mg-1。GBV-PA為一種絲氨酸蛋白酶，與纖維蛋白無特異性的親和力。 應(yīng)用三種不同的血栓模型研究蛇毒纖溶酶原激活劑的抗栓作用，結(jié)果表明：分離純化到的蛇毒纖溶酶原激活劑對(duì)于動(dòng)靜脈血栓均有良好的溶解作用，在一定范圍內(nèi)呈明顯的量效和時(shí)效關(guān)系，且對(duì)血栓的形成有抑制作用。采用經(jīng)典的Bor

6、n法，測(cè)定GBV-PA對(duì)ADP和凝血酶誘導(dǎo)的體外血小板聚集的影響，結(jié)果顯示：GBV-PA對(duì)ADP和凝血酶誘導(dǎo)的血小板聚集均有抑制作用，呈明顯的量效關(guān)系。ADP誘導(dǎo)的急性肺栓塞和大鼠頸動(dòng)靜脈回路血栓模型觀察GBV-PA對(duì)體內(nèi)血小板聚集的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明GBV-PA可抑制體內(nèi)血小板聚集。 成功地從江浙短尾蝮蛇毒中獲得GBV-PA的核苷酸序列，GBV-PA的cDNA大小為777bp，推導(dǎo)出的氨基酸數(shù)目為259個(gè)。GBV-PA核苷酸序

7、列與TSV-PA和Haly-PA的同源性分別為91％，和96％。將該基因定向克隆到原核表達(dá)載體pET42a(+)中，并在大腸桿菌中得到表達(dá)，SDS-PAGE凝膠電泳顯示rGBV-PA主要以包涵體形式存在，分子量約61.7kDa。rGBV-PA經(jīng)His親和層析柱純化后，獲得的rGBV-PA融合蛋白具有蝮蛇毒的抗原性。 結(jié)論： (1)成功地從江浙短尾蝮蛇毒中分離純化到分子量為32kDa左右，等電點(diǎn)為5.2的纖溶酶原激活劑，命