異丙酚對內(nèi)毒素刺激下中性粒細(xì)胞的功能及TLR2-4受體表達(dá)的影響.pdf

1、內(nèi)毒素(脂多糖)是革蘭氏陰性菌細(xì)胞外壁的主要成分，發(fā)牛內(nèi)毒素血癥時(shí)在機(jī)體內(nèi)可與炎性細(xì)胞的受體接合，激活炎性細(xì)胞，合成和釋放細(xì)胞因子，誘導(dǎo)全身炎癥反應(yīng)，從而導(dǎo)致膿毒性休克甚至多器官衰竭。新近研究發(fā)現(xiàn)，Toll簇受體(Toll-like receptors)可能是LPS跨膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的門戶蛋白，影響細(xì)胞對內(nèi)毒素的反應(yīng)和宿主對細(xì)菌的防御反應(yīng)。其中TLR2(Toll-like receptor2)和TLR4(Toll-like receptor4

2、)作用尤為顯著。以往研究主要集中于LPS對單核巨噬細(xì)胞上TLR2/4的影響；中性粒細(xì)胞(PMN)是機(jī)體重要的免疫細(xì)胞，在機(jī)體炎癥反應(yīng)中起著重要作用，脂多糖(lipopolysacchadde，LPS)對中性粒細(xì)胞TLR2和LR4有何影響尚不明確。異丙酚是常用的靜脈麻醉藥，研究發(fā)現(xiàn)異丙酚具有一定的抗LPS引起的炎癥反應(yīng)，異丙酚是否能夠影響中性粒細(xì)胞的TLR2/g表達(dá)尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)通過體外分離純化PMN，觀察LPS作用后PMN的TLR2/

3、4表達(dá)，異丙酚預(yù)處理對PMN的TLR2/4表達(dá)的影響，異丙酚對內(nèi)毒素刺激PMN后的功能變化，如PMN上粘附分子CD18的表達(dá)、呼吸爆發(fā)，IL-8(白介素-8)和腫瘤壞死因子-a(TNF-a)釋放及PMN凋亡的影響。 試驗(yàn)方法： 1.標(biāo)本采集與細(xì)胞分離提純： 采集6位健康成年志愿者(年齡20-35歲)外周靜脈血50 ml/位，加入20U/ml肝素抗凝，用于分離中性粒細(xì)胞。采用密度梯度法分離純化PMN，即先以淋巴細(xì)

4、胞分離液將單個核細(xì)胞與中性粒細(xì)胞分離于不同液面，再用紅細(xì)胞裂解液裂解殘留的紅細(xì)胞，PBS洗兩次，用含10％胎牛血清的1640培養(yǎng)液重懸細(xì)胞。經(jīng)瑞氏染色證實(shí)純度＞90％，臺盼藍(lán)染色證實(shí)存活率＞95％。調(diào)節(jié)每組細(xì)胞濃度均為1×106個/ml。 2.實(shí)驗(yàn)分組及處理：將預(yù)處理好的PMN均分為六組：Ⅰ組(空白對照組，PMN+培養(yǎng)液)，Ⅱ組(異丙酚溶劑對照組，intralipid)，Ⅲ組(異丙酚組，終濃度5μg/ml異丙酚)，Ⅳ組(

5、內(nèi)毒素組，終濃度1μg/ml LPS)，V組(內(nèi)毒素+溶劑對照組，intralipid+終濃度1μ g/ml LPS)，Ⅵ組(異丙酚+內(nèi)毒素組，終濃度5 μg/ml異丙酚+終濃度1μg/ml LPS)。Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅴ組、Ⅵ組先加入異丙酚或(和)intralipid，在37℃，5％的CO2培養(yǎng)箱孵育20 min后(Ⅰ組不加樣，但經(jīng)同樣條件預(yù)處理)，Ⅳ組、Ⅴ組、Ⅵ組中加入LPS，最后各組均于在37℃，5％的CO2培養(yǎng)箱孵育12小時(shí)。

6、 3.研究方法與觀察指標(biāo) (1)中性粒細(xì)胞黏附分子CD18的表達(dá)量：每組取100μ1細(xì)胞懸液，加入10μ 1 FITC Anti-Human CD18單克隆抗體，室溫避光孵育30min，PBS洗2次，300μ1 PBS重懸細(xì)胞。 (2)呼吸爆發(fā)功能的測定：每組取100μ1細(xì)胞懸液，加入25μ1 DHR123(終濃度為4μg/ml)，37℃水浴箱避光孵育5 min，將盛標(biāo)本的試管置于冰浴中以終止反應(yīng)，PBS洗2次，300μ

7、1PBS重懸細(xì)胞。 (3)中性粒細(xì)胞的凋亡率：每組取100μ1結(jié)合液重懸的細(xì)胞懸液，加入5μ1V/FITC和10μ1碘化丙錠溶液，混勻室溫避光孵育15min，加入300μ1PBS重懸細(xì)胞。 (4)中性粒細(xì)胞TLR2、TLR4的表達(dá)量：每組取100μ1細(xì)胞懸液，分別加入5μ1FITC Anti-Human TLR-2、PI Anti-Human TLR-4單克隆抗體，室溫避光孵育20min，PBS洗2次，300 μ 1 P

8、BS重懸細(xì)胞。 (5)培養(yǎng)上清液TNF-a、IL-8的濃度：離心收集細(xì)胞培養(yǎng)液，采用ELISA法檢測培養(yǎng)液中FNF-a、IL-8的濃度。 (6)中性粒細(xì)胞TLR2、TLR4、TNF-a、IL-8 mRNA表達(dá)：提取PMN的總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA后，采用熒光定量PCR的方法檢測中性粒細(xì)胞TLR2、TLR4、TNF-a、IL-8基因表達(dá)變化表達(dá)。 4.統(tǒng)計(jì)分析 所有數(shù)據(jù)采用SPSS12.0 for Wi

9、ndows進(jìn)行處理。對數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)、方差齊性檢驗(yàn)，正態(tài)分布的計(jì)量數(shù)據(jù)采用-x±s表示，應(yīng)用方差分析進(jìn)行分析；非正態(tài)分布以中位數(shù)(四分位數(shù)間距)[M(Q)]表示， 采用秩和檢驗(yàn)(Wilcoxon Signed Ranks Test)；以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果： 1、PMN的呼吸爆發(fā)作用 Ⅴ組呼吸爆發(fā)作用較Ⅰ組增強(qiáng)(P＜0.05)；與Ⅵ組比較，Ⅴ組呼吸爆發(fā)作用增強(qiáng)(P＜0.05)；Ⅳ組呼吸爆

10、發(fā)作用較Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組均有升高趨勢，但均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。Ⅵ組較Ⅴ組呼吸爆發(fā)作用減弱(P＜0.05)。 2、PMN的凋亡率變化 Ⅳ、Ⅴ組PMN早期凋亡率小于Ⅰ組(P＜0.05)；與Ⅳ組比較，早期凋亡率較Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組均減少(P＜0.05)，Ⅴ組早期凋亡率變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，Ⅵ組早期凋亡率較Ⅳ組升高(P＜0.05)。Ⅵ組早期凋亡率大于Ⅴ組(P＜0.05)。 3、PMN上CD18表達(dá)的變化 Ⅴ、Ⅵ組CD18表達(dá)較Ⅰ組有

11、增高(P＜0.05)；與Ⅳ組比較，CD18表達(dá)較Ⅰ組有增高趨勢，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。Ⅵ組CD18表達(dá)較V組有降低(P＜0.05)。 4、細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-8、TNF-a的濃度 Ⅳ組、Ⅴ組、Ⅵ組中IL-8的濃度均大于Ⅰ組(P＜0.05)；與Ⅳ組比較；Ⅵ組IL-8的濃度較Ⅴ組降低(P＜0.05)。 Ⅳ組中TNF-a的濃度均大于Ⅰ組(P＜0.05)；與Ⅳ組比較，Ⅴ組細(xì)胞培養(yǎng)液中。TNF-a的濃度變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；與Ⅴ組比較

12、，Ⅵ組TNF-a的濃度較Ⅴ組降低(P＜0.05)。 5、IL-8mRNA、TNF-amRNA表達(dá)Ⅴ組IL-8mRNA表達(dá)較Ⅰ、Ⅱ組升高(P＜0.05)；Ⅳ組中IL-8mRNA表達(dá)量均大于Ⅰ組，Ⅵ組較Ⅳ組有降低趨勢，但均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；與Ⅴ組比較，Ⅵ組IL-8mRNA表達(dá)降低(P＜0.05)，但亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 Ⅵ組中TNF-a mRNA的表達(dá)量小于V組中TNF-a mRNA的表達(dá)量(P＜0.05)，其余各組兩兩比較無差異

13、。 6、PMN上TLR2、 TLR4表達(dá)的變化 Ⅳ、Ⅴ組TLR2表達(dá)較Ⅰ組升高，V組TLR4表達(dá)較Ⅰ組升高(P＜0.05)，與Ⅳ組比較，Ⅴ組TLR2、TLR4表達(dá)變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，Ⅵ組TLR2表達(dá)較Ⅳ組降低(P＜0.05)。與Ⅴ組比較，Ⅵ組TLR2、TLR4表達(dá)降低。 7、TLR2mRNA、TLR4mRNA表達(dá) Ⅴ組TLR2mRNA表達(dá)較Ⅲ組升高(P＜0.05)；Ⅳ、Ⅴ組TLR2mRNA表達(dá)較Ⅰ組有升高

14、趨勢，Ⅵ組TLR2mRNA表達(dá)較Ⅳ、Ⅴ組均有降低趨勢，但均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 Ⅳ組TLR4mRNA表達(dá)較Ⅰ組有升高趨勢，Ⅵ組TLR4mRNA表達(dá)較Ⅴ組有降低趨勢，但均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 結(jié)論： 1、內(nèi)毒素可使呼吸爆發(fā)能力增強(qiáng)、凋亡延遲、增加PMN粘附分子CD18的表達(dá)。 2、異丙酚可減弱PMN呼吸爆發(fā)功能、改善PMN凋亡障礙、降低內(nèi)毒素刺激下PMN粘附分子CD18的表達(dá)增加。 3、內(nèi)毒素可誘發(fā)PMN釋放炎癥