TLR9激動劑誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡及其與TLR3激動劑的相互作用.pdf

1、目的
　　 Tolllikereceptors(TLRs)是模式識別受體中的一個家族。到目前為止,人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了至少11種人類的TLRs。TLRs表達(dá)在多種免疫細(xì)胞上,尤其是抗原遞呈細(xì)胞,如樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和B細(xì)胞等等。大量的研究已經(jīng)表明Toll樣受體在天然免疫應(yīng)答以及對抗微生物感染和組織損傷的適應(yīng)性免疫應(yīng)答中起著重要的作用。
　　 因為TLRs在免疫應(yīng)答中起著如此重要的作用,早期的研究都是立足于表達(dá)在免疫細(xì)胞上的T

2、LRs的生物學(xué)功能和其重要性。然而,TLRs也表達(dá)在一些腫瘤細(xì)胞上,如黑色素瘤細(xì)胞、頭部腫瘤以及結(jié)腸癌等都有表達(dá)。之前有研究表明,表達(dá)在腫瘤細(xì)胞上的TLRs對腫瘤的發(fā)生發(fā)展起著重要的作用。例如,人頭頸部鱗癌細(xì)胞系上的TLR4被激活后能夠促進(jìn)腫瘤的發(fā)展,并保護(hù)腫瘤細(xì)胞逃避免疫系統(tǒng)攻擊;而用鞭毛蛋白活化乳腺癌細(xì)胞的TLR5后能夠抑制細(xì)胞增殖從而抑制腫瘤的生長。這表明不同的TLRs在腫瘤中發(fā)揮著不同的作用。因此,研究表達(dá)在腫瘤上的TLRs的功

3、能是至關(guān)重要的。
　　 肝癌是最常見的惡性腫瘤之一,在中國由肝癌引起的死亡率位居第三,對人類健康和生存產(chǎn)生了巨大的威脅。因此,急需尋找一種更為有效的治療肝癌的方法。TLRs在肝癌細(xì)胞上都有表達(dá)。有研究報道,腫瘤細(xì)胞上的TLR9活化能抑制細(xì)胞增殖促進(jìn)細(xì)胞凋亡,有關(guān)TLR9激動劑對肝癌細(xì)胞的影響尚無報導(dǎo);另外,TLR3激動劑polyI:C能促進(jìn)肝癌細(xì)胞的凋亡,那么,TLR9激動劑與TLR3激動劑聯(lián)合應(yīng)用對肝癌細(xì)胞的作用亦無報導(dǎo)。因此

4、,本文旨在探討TLR9激動劑單獨(dú)及TLR3和TLR9激動劑聯(lián)合對肝癌的抗腫瘤作用。
　　 方法
　　 1.RT-PCR檢測TLRs在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)情況;
　　 2.細(xì)胞轉(zhuǎn)染:用Lipofectamine2000介導(dǎo)的方法將ODNM362Ctrl、ODNM362、ODN2006-G5、polyI:C以及TLR9特異性siRNA轉(zhuǎn)入HepG2和H7402細(xì)胞;
　　 3.MTT法檢測轉(zhuǎn)染ODNM362Ctr

5、l、ODNM362后細(xì)胞增殖情況;
　　 4.流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期;
　　 5.實時定量PCR檢測細(xì)胞因子、受體及凋亡相關(guān)分子的基因表達(dá);
　　 6.WesternBlot法檢測RIG-I、NF-κB、p-NF-κB以及IκB-α的蛋白表達(dá)水平;
　　 7.熒光檢測細(xì)胞凋亡及siRNA或pEGFP-N1進(jìn)入細(xì)胞的效率;
　　 8.人肝癌細(xì)胞系HepG2細(xì)胞裸鼠皮下荷瘤;
　　

6、9.瘤內(nèi)注射TLR9激動劑治療HCC
　　 結(jié)果
　　 1.TLR9激動劑能通過TLR9非依賴的途徑誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡
　　 1.1TLR在肝癌細(xì)胞上的表達(dá)水平,除了TLR7、TLR8,其它的TLRs在三種肝癌細(xì)胞系中都有表達(dá),TLR9的表達(dá)水平也較高;
　　 1.2ODNM362及ODNM362Ctrl均能抑制人肝癌細(xì)胞增殖,對H7402細(xì)胞的抑制作用更為明顯;
　　 1.3ODNM362及ODN

7、M362Ctrl對肝癌細(xì)胞周期無影響,但出現(xiàn)了明顯的凋亡峰,提示ODNM362及ODNM362Ctrl誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡;
　　 1.4ODNM362及ODNM362Ctrl能誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡,對H7402細(xì)胞的促凋亡作用更為顯著;
　　 1.5ODNM362和ODNM362Ctrl能上調(diào)TLR9和炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-6、IL-8、IFN-α、IFN-β的表達(dá);
　　 1.6ODNM362和ODNM362Ct

8、rl對IB-α及磷酸化的NFκB蛋白表達(dá)無影響,不能活化NFκB信號通路;
　　 1.7沉默TLR9后,ODNM362和ODNM362Ctrl誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞的凋亡無變化,是TLR9非依賴的;
　　 1.8轉(zhuǎn)染ODNM362的H7402細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)無法成瘤,ODNM362抑制體內(nèi)腫瘤的形成;
　　 1.9ODNM362瘤內(nèi)注射抑制體內(nèi)腫瘤的生長。
　　 2.硫代磷酸酯修飾的TLR9配體通過阻止TLR3配體

9、的進(jìn)入從而抑制其誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡
　　 2.1TLR9激動劑ODNM362能夠通過誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞凋亡抑制其增殖;
　　 2.2在結(jié)腸癌細(xì)胞系中ODNM362也能削弱由polyI:C誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡;
　　 2.3ODNM362能夠下調(diào)識別polyI:C的受體RIG-(I)、MDA5、LGP2、TLR3的表達(dá);
　　 2.4ODNM362能夠下調(diào)由polyI:C誘導(dǎo)的凋亡基因Noxa、puma等的表達(dá);

10、　　 2.5ODNM362能夠下調(diào)由polyI:C誘導(dǎo)的炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-6、IL-8、IFN-α、IFN-β的表達(dá);
　　 2.6在結(jié)腸癌細(xì)胞系中ODNM362也能削弱由polyI:C誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡;
　　 2.7硫代磷酸酯修飾的ODNM362Ctrl、ODNM362均能削弱polyI:C誘導(dǎo)的凋亡,而非硫代磷酸酯修飾的ODN2006-G5不能,CpGODN阻斷polyI:C誘導(dǎo)的凋亡依賴于其硫代磷酸酯的

11、修飾;
　　 2.8硫代磷酸酯修飾的CpGODN抑制熒光標(biāo)記的siRNA或pEGFP-N1進(jìn)入細(xì)胞,硫代磷酸酯修飾的CpGODN抑制polyI:C誘導(dǎo)的凋亡是通過阻斷polyI:C的進(jìn)入實現(xiàn)的;
　　 2.9可以通過預(yù)先轉(zhuǎn)染CpGODN增強(qiáng)polyI:C的促凋亡作用。
　　 結(jié)論
　　 本研究發(fā)現(xiàn),除了TLR7、TLR8,其它的TLRs在三種肝癌細(xì)胞系中都有表達(dá),TLR9的表達(dá)水平也較高。TLR9配體OD

12、NM362及其對照ODNM362Ctrl均能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡從而抑制細(xì)胞增殖;TLR9和促炎因子的表達(dá)也有所上調(diào),但是不能活化NFκB信號通路。ODNM362能抑制腫瘤在體內(nèi)的形成和生長。
　　 本研究還發(fā)現(xiàn),同時轉(zhuǎn)染polyI:C和ODNM362相比polyI:C單獨(dú)作用組細(xì)胞凋亡顯著下降,同時識別polyI:C的受體、促炎因子以及凋亡相關(guān)分子也都顯著下調(diào)。進(jìn)一步的研究表明,這些效應(yīng)是部分依賴于TLR9配體硫代磷酸酯修飾的結(jié)構(gòu),該