核糖核酸酶抑制因子基因修飾對其功能的影響.pdf

1、目前認(rèn)為RI有以下功能:1.一些細(xì)胞質(zhì)核糖核酸酶(RNases)可以通過分泌腺分泌、內(nèi)吞或者靶向錯誤而進(jìn)入細(xì)胞,與RNA作用,降解RNA,影響轉(zhuǎn)錄與翻譯.RI則可以起到一個'衛(wèi)兵'的作用來保護(hù)細(xì)胞免受外來RNases的損傷.試驗(yàn)證明,非胞質(zhì)RNases對RI非常敏感,是RI的天然底物,它們對不含有RI的哺乳動物細(xì)胞具有很高的毒性;2.核糖核酸酶超家族成員之一血管生成因子(Angiogenin,Ang)是腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞分泌的分子量為1

2、4.4kD的蛋白質(zhì),在體內(nèi)外具有強(qiáng)烈的誘發(fā)血管生成的活性.RI也是Ang的高效抑制劑,能與其緊密結(jié)合抑制其促進(jìn)血管生成的活性.是一種很有潛力的抗腫瘤血管藥;3.RI具有較強(qiáng)的抗氧化損傷能力.可以通過富含的還原型巰基來抵抗氧化物質(zhì)對細(xì)胞的損傷,防止脂質(zhì)過氧化.4.RI可以調(diào)節(jié)某些不起RNA抑制作用的RNase家族成員的生物功能.該實(shí)驗(yàn)主要是采用突變的方法研究RI的結(jié)構(gòu)與抗氧化功能的關(guān)系,為理論研究提供直接的實(shí)驗(yàn)依據(jù),并且期望得到更穩(wěn)定和更

3、具生物學(xué)活性的hRI突變體.具體突變方法是通過缺失突變除去hRI N端10個氨基酸殘基及采用基因特異性點(diǎn)突變的方法用Ala取代Cys328、Cys329.該實(shí)驗(yàn)主要做了以下工作:1將逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLNCX與hR1 cDNA形成的重組子(pLNCX-RI)、pLNCX與用Ala替代Cys328和Cys329的hRI cDNA突變體形成的重組子(pLNCX-mutation),以及pLNCX與N端切去10個氨基酸殘基的hRI cDNA突變

4、體形成的重組子(pLNCX-N10)分別用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染C6細(xì)胞,用G418篩選出含有穩(wěn)定重且子的C6細(xì)胞,經(jīng)PCR進(jìn)行鑒定,用Western Blot證明轉(zhuǎn)RI的C6細(xì)胞RI過表達(dá).2以不同濃度H<,2>O<,2>損傷未轉(zhuǎn)染C6細(xì)胞和以轉(zhuǎn)染的上述3種C6細(xì)胞,拍照并經(jīng)MTT法檢測細(xì)胞存活率,比較上述4種細(xì)胞的抗氧化能力.3將上述4種細(xì)胞各分為二組(實(shí)驗(yàn)組和對照組),對照組加PBS緩沖液,實(shí)驗(yàn)組加1mmol/LH<,2>O<,2>損傷,比