核糖核酸酶抑制因子的基因修飾對其活性的影響.pdf

1、核糖核酸酶抑制因子中至少有30個還原型巰基,使HRI具有防止脂質(zhì)過氧化損傷的功能.用丙氨酸同時取代Cys328和Cys329可以提高HRI 7-9倍的抗氧化損傷能力.為了進(jìn)一步了解雙點突變的HRI是否能提高細(xì)胞內(nèi)的抗脂質(zhì)過氧化損傷能力,我們研究了雙點突變后HRI和野生型HRI對過氧化氫損傷的大鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞C6的影響,將Cys328Ala和Cys329Ala雙點突變的HRI cDNA片段和野生型HRI cDNA片段重新構(gòu)建逆轉(zhuǎn)錄病毒載

2、體pLNCX,并采用脂質(zhì)體的方法轉(zhuǎn)染大鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系C6,經(jīng)Western雜交檢測證明雙點突變的HRI在C6細(xì)胞中過表達(dá).用不同濃度的H<,2>O<,2>分別作用于轉(zhuǎn)染的突變型HRI和野生型HRI過表達(dá)的C6細(xì)胞及正常C6細(xì)胞,對比損傷前后三者的細(xì)胞存活率、MDA含量差別,以及細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶CAT、SOD的活性差別.實驗結(jié)果表明,HRI可以通過巰基直接清除氧自由基造成的脂質(zhì)過氧化損傷,也可以通過提高細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶的活性,清除過多自由

3、基;而Cys328Ala和Cys329Ala雙點突變的HRI因在兩個半胱氨酸之間不能形成二硫鍵,可能穩(wěn)定了整個HRI分子的立體結(jié)構(gòu),進(jìn)而使突變型HRI在降低脂質(zhì)過氧化損傷程度以及提高細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶活性的能力上較野生型HRI有所提高.為更好的了解HRI與Ang和RNase A的結(jié)合位點及它們之間高親和性的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ),合理設(shè)計抗腫瘤血管新藥.該文用PCR的方法在HRI cDNA 5'端去除30個堿基,并將此缺失突變的HRI的cDNA片段構(gòu)建于

4、質(zhì)粒pPIC9K,電擊轉(zhuǎn)化入畢赤酵母(Pichia pastores)GS115中,進(jìn)行分泌型表達(dá).對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行親和層析純化.檢測N端缺失突變的HRI對RNase A的親和力及RNase A抑制活性的影響,結(jié)果表明,N-端缺失突變的HRI與RNase A的親合力較野生型HRI降低一倍,但依然具有競爭性抑制RNase A的活性,表明HRI N-末端10個氨基酸殘基對于RNase A活性的抑制并不重要,缺失后不影響HRI的活性.為了進(jìn)一步

5、了解N-端缺失10個氨基酸殘基對HRI活性的改變,我們研究了突變后HRI和野生型HRI對過氧化氫損傷的大鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞C6的影響,將HRI 5'端缺失30個堿基的HRI cDNA片段和野生型HRI cDNA片段重新構(gòu)建逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLNCX,并采用脂質(zhì)體的方法轉(zhuǎn)染大鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系C6,經(jīng)Western雜交檢測證明N-端缺失突變的HRI在C6細(xì)胞中過表達(dá).用不同濃度的H<,2>O<,2>分別作用于轉(zhuǎn)染有突變型HRI和野生型HRI過