超聲激活血卟啉對H22腫瘤細胞抑制效應(yīng)的實驗初探.pdf

1、腫瘤，尤其是惡性腫瘤，是一種直接威脅人類生命安全的疾病，1996年全球新發(fā)惡性腫瘤病例1000多萬，我國每年新發(fā)惡性腫瘤病例160-200萬，預(yù)計今后20年這個發(fā)病率還可能再增加一倍。因此，對腫瘤的防治，是當前世界醫(yī)學領(lǐng)域研究極為重要的課題。目前，防治腫瘤的常規(guī)方法有：手術(shù)治療，放射治療和化學治療等。這些方法各有利弊：手術(shù)治療是采用手術(shù)切除腫瘤，在治療早期沒有轉(zhuǎn)移和與重要臟器及大血管無嚴重粘連的腫瘤方面效果較好，但中晚期效果不佳；放射治

2、療是利用同位素衰變和加速器產(chǎn)生的射線治療惡性腫瘤，腫瘤一旦擴散或局部侵潤廣泛，放療就達不到治療效果，且放療本身也會帶來一些近期或遠期副作用；化學療法是利用化學抗腫瘤藥物治療惡性腫瘤的主要手段，但化療藥物毒副作用較大，主要有惡心，嘔吐，脫發(fā)，白細胞減少等。因此，尋找選擇性好，副作用小的防治惡性腫瘤的新方法，是當今醫(yī)學研究的熱點。超聲波作為一種機械能量形式，具有穿透力強，定向傳播等特點，在物理學，化學，醫(yī)學和生物學等各領(lǐng)域有著廣泛的用途，尤

3、其是在腫瘤治療中已引起國內(nèi)外的普遍關(guān)注。1989年，日本學者Umemura．S首次報道了利用超聲能夠激活血卟啉產(chǎn)生抗腫瘤效應(yīng)，并稱之為聲動力學療法(Sonodynamic therapy，SDT)。現(xiàn)普遍認為聲動力治療是指利用超聲能夠穿透生物組織，激活癌細胞內(nèi)富集并長時間潴留的聲敏劑如血卟啉產(chǎn)生具有高氧化活性的單線態(tài)氧等自由基，引起腫瘤細胞不可逆的損傷治癌新法。由于聲敏劑對腫瘤細胞的聚集性和外部超聲波照射的選擇性而對健康組織基本沒有損害

4、或損害較小，毒副作用相對也較小，無耐藥性，且可以與其它治療手段協(xié)同作用等特點，SDT一經(jīng)出現(xiàn)立即受到各國腫瘤研究專家們的重視，國內(nèi)外學多學者做了大量的相關(guān)研究工作，目前關(guān)于超聲激活血卟啉抗瘤效應(yīng)還處于研究階段，就超聲激活血卟啉的可行性，對腫瘤的作用效果，實驗參數(shù)的選擇以及作用機理等進行了探討，并取得了初步成效。 使用的輻射聲源有平面超聲，聚焦超聲等；使用聲敏劑有卟啉類，包括血卟啉，卟啉Ⅱ，ATX-70，還有非卟啉類包括抗癌藥物和

5、化療藥物等；取得聲學參量范圍：頻率 210 kHZ-2.0 MHZ，聲強度 150 mW/cm<'2>-3.2 W/cm<'2>；離體作用時間 15-60s，在體作用時間 2-10min；所研究的腫瘤細胞有 S180，AH130，HL-60，VX2，以及人體腫瘤細胞LiBr，K562等；關(guān)于聲動力治療腫瘤的機制有單線態(tài)氧機制，自由基理論和空化效應(yīng)等。本論文在綜合國內(nèi)外研究進展的基礎(chǔ)上，結(jié)合本實驗室前期研究成果，依托國家自然科學基金項目“

6、超聲激活血卟啉抗腫瘤細胞的分子生物學機制”和“超聲激活血卟啉誘導腫瘤細胞凋亡的分子機制的研究”的支持，采用頻率為1.43 MHz的聚焦超聲結(jié)合聲敏劑血卟啉對小鼠H22腫瘤細胞進行體內(nèi)體外的抑制效應(yīng)的實驗研究，取得實驗結(jié)果如下： 1．通過H22腫瘤細胞對不同濃度血卟啉吸收的實驗發(fā)現(xiàn)，血卟啉進入H22腫瘤細胞內(nèi)的吸收量并不隨時間延長而無限增加，可能存在相對“飽和”。實驗結(jié)果表明，在加入不同濃度血卟啉后，達到相對飽和狀態(tài)的時間是不同的

7、，但60min-120min時，腫瘤細胞對血卟啉的吸收基本達到相對飽和狀態(tài)，因此，最佳的血卟啉孵育時間為60min。 2．通過H22腫瘤細胞實驗參量優(yōu)化篩選研究發(fā)現(xiàn)，單純超聲處理和超聲血卟啉處理H22腫瘤細胞的過程中存在著閾值聲強和閾值血卟啉劑量。當聲強小于2 W/cm<'2>時，超聲處理對細胞存活率影響不顯著；而當聲強大于2 W/cm<'2>時，超聲對細胞的殺傷作用明顯，甚至達到50％以上，而且存活率隨著聲強的加大而顯著下降。

8、在超聲聯(lián)合血卟啉處理時，血卟啉濃度小于50 μg/ml時，超聲與血卟啉沒有表現(xiàn)出協(xié)同殺傷作用；而大于50 μg/ml時，超聲血卟啉組與超聲組和對照組的殺傷率有極顯著差異，并且隨著血卟啉濃度的增加，差異愈加明顯，單純血卟啉對腫瘤細胞的存活率沒有影響。不同實驗參量作用腫瘤細胞，就會產(chǎn)生不同的殺傷機制，考慮到本研究的目的，我們最終擬選擇2 W/cm<'2>聲強聯(lián)合100 μg/ml血卟啉處理離體H22腫瘤細胞60s，來研究處理后腫瘤細胞發(fā)生的

9、動態(tài)生理生化變化，探討細胞死亡的機制。 3．通過對處理后H22腫瘤細胞形態(tài)和生化方面的檢測，證實1.43 MHz，2 W/cm<'2>的聚焦超聲可通過誘導H22細胞凋亡而致其死亡，并且凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3，F(xiàn)as/FasL，Bcl-2蛋白的表達發(fā)生極其顯著的變化，提示在超聲誘導H22腫瘤細胞死亡的過程中可能同時存在著死亡受體和線粒體兩種凋亡途徑4．通過小鼠H22肝癌移植瘤模型的建立，研究超聲激活血卟啉對H22荷瘤小鼠的