RNAi技術(shù)沉默細(xì)胞色素C氧化酶對該基因表達調(diào)控的研究.pdf

1、中山大學(xué)碩士學(xué)位論文RNAi技術(shù)沉默細(xì)胞色素C氧化酶對該基因表達調(diào)控的研究姓名：陳艷申請學(xué)位級別：碩士專業(yè)：腫瘤學(xué)指導(dǎo)教師：吳秋良邵建永20050525墜!甾拉苤速叢塹!!塑也耋￡芏i絲鷥塑遮基凼垂叢趟地鮑蜮巍隧地亟』二堂絲適皇穩(wěn)定表達小于擾RNA(smallinterferenceRNA，siRNA)的細(xì)胞株，在細(xì)胞學(xué)水平上研究了MTCOX對細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡方面的影響。本實驗結(jié)果為研究MTCOX基因功能和線粒體在鼻咽癌基因治療方

2、面的應(yīng)用提供了一定的實驗依據(jù)；RNA干擾技術(shù)在MTCOXI基因沉默過程的應(yīng)用，為這一領(lǐng)域的研究工作提供了方便、特效、快捷的手段。方法；根據(jù)Genbank中報道的MTCOX—I的核苷酸序列(NM173704)，參考siRNA的設(shè)計策略，選取了4個RNAi的位點，設(shè)計合成針對其編碼區(qū)的DNA寡核苷酸單鏈；退火后形成雙鏈，插入到pENTR／U6質(zhì)粒缺口末端，構(gòu)建含RNAi盒的pENTR／U6載體：通過重組作用將pENTR／U6載體的RNAi盒

3、重組到pLenti6／BL0cK—iT—Dest載體上，構(gòu)建含U6啟動子、靶序列和PolIII終止子表達框的MTCOX—IshRNA表達重組體；經(jīng)脂質(zhì)體導(dǎo)入293FT細(xì)胞，包裝成慢病毒，經(jīng)過篩選獲得穩(wěn)定表達的細(xì)胞株。Westernblot檢測干擾前后及不同干擾組細(xì)胞內(nèi)MTCOX—I亞基和其上游底物細(xì)胞色素C(cytochromeC，Cyt—c)的表達變化；軟瓊脂集落形成實驗檢測干擾前后細(xì)胞克隆能力變化，MTT比色法檢測干擾前后細(xì)胞OD值

4、一時間曲線的改變，TUNEL實驗檢測細(xì)胞凋亡，電鏡觀察線粒體超微結(jié)構(gòu)變化。結(jié)果：l、pENTR／U6載體測序分析結(jié)果顯示插入片段序列無核苷酸突變，插入位置正確；靶序列和U6啟動子、PolIII終止子連接生成U6RNAi表達框；生成J下確的入門克隆。2、MTCOX—IshRNA表達重組體測序分析結(jié)果顯示表達克隆內(nèi)生成正確的含u6啟動子、靶序列和PolIlI終止子的表達框，入門克隆內(nèi)含U6啟動子的RNAi盒連接到表達克隆上，表達載體構(gòu)建成功