辣根素(AITC)對玉米象線粒體細胞色素C氧化酶核心亞基作用位點研究.pdf

1、玉米象是一種世界性倉儲害蟲，每年因玉米象的危害給人類造成重大的經(jīng)濟損失。目前市場上熏蒸劑如磷化氫、硫酰氟、溴甲烷等在玉米象的防治中發(fā)揮了巨大作用，但由于此類藥劑長期大量不科學(xué)使用，導(dǎo)致玉米象產(chǎn)生了嚴(yán)重的抗藥性，同時也加劇了對高等生物和大氣環(huán)境的安全風(fēng)險，限制了它們在儲糧害蟲防治上與管理中的持久應(yīng)用。辣根素(AITC)是一種從植物中提取的異硫氰酸酯類化合物，具有植物源殺蟲劑安全、低殘留等優(yōu)點，并對倉儲害蟲具有較好的熏蒸殺蟲效果，被認為是一

2、種潛在的植物源熏蒸劑。目前關(guān)于AITC殺蟲機理尚無定論，明確AITC對倉儲害蟲的作用機制，有助于指導(dǎo)AITC高效、科學(xué)、合理使用。本研究以玉米象成蟲為研究對象，在課題組前期研究基礎(chǔ)上從基因克隆、載體構(gòu)建與表達分析、蛋白純化、同源建模與分子對接等幾個方面開展試驗工作，探索AITC對玉米象線粒體細胞色素c氧化酶(COX)核心亞基作用影響，研究取得的主要結(jié)果如下:
　　1、玉米象成蟲線粒體核心亞基COXⅠ/Ⅱ/Ⅲ基因克隆與序列分析。通過

3、改進后的CTAB法提取玉米象成蟲總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA，結(jié)合RACE和RT-PCR策略克隆獲得玉米象線粒體COXⅡ/Ⅲ的開放閱讀框(ORF)，并獲得了COXⅡ登錄號:GenBank KX783028。生物信息學(xué)分析表明，COXⅠ基因的ORF為1542 bp，編碼513氨基酸(amino acid, aa)，蛋白分子量(Molecular weight，Mw)為57061.12，理論等電點（Isoelectric point

4、，pI）為6.33，起始密碼子為AUU，終止密碼子為UAA; COXⅡ基因的ORF為684 bp，編碼227 aa，Mw為26237.88，pI為6.37，起始密碼子為AUA，終止密碼子為UAA; COXⅢ的ORF為792bp，編碼263 aa，Mw為30938.1，pI為6.51，起始密碼子為AUG，終止密碼子為UAA。
　　2、玉米象線粒體核心亞基COXⅠ/Ⅱ/Ⅲ載體構(gòu)建與原核表達。對COXⅠ/Ⅱ/Ⅲ三個核心亞基基因均構(gòu)建了p

5、ET系列載體(pET28a、 pET30a、pET32a、pET42a)和pEASY-Blunt E1重組體，并成功轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coli BL21(DE3)中。誘導(dǎo)后經(jīng)SDS-PAGE和Western Blot(WB)驗證，只有pET42-COXⅡ-E.coli BL21(DE3)、pET32-COXⅢ-E.coliBL21(DE3)得以表達，融合蛋白分子量分別為44kD和62kD，其中COXⅢ主要以包涵體形式存在，COXⅡ以可溶性

6、形式存在上清液中。試驗對pET42-COXⅡ-E.coli BL21(DE3)可溶性條件進行了優(yōu)化，結(jié)果顯示在溫度16℃、IPTG為1 mmol L-1、轉(zhuǎn)速180rpm，誘導(dǎo)24h后上清液中COXⅡ含量最高，并通過Ni+-NTA柱對COXⅡ進行蛋白純化以及濃度測定，測得COXⅡ蛋白濃度為50μg/mL。
　　3、玉米象線粒體核心亞基COXⅠ/Ⅱ/Ⅲ在畢赤酵母GS115中的嘗試表達。PP5軟件設(shè)計含有EcoRⅠ和KpnⅠ酶切位點的

7、引物，經(jīng)克隆、酶切、連接等構(gòu)建了pPICZα-COXⅠ/Ⅱ/Ⅲ重組表達載體，經(jīng)雙酶切和測序后，基因序列正確，無突變發(fā)生。用線性化酶SacⅠ對上述三個重組體進行線性化后，電轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115感受態(tài)細胞，成功構(gòu)建轉(zhuǎn)化子。
　　4、玉米象線粒體核心亞基COXⅠ/Ⅱ/Ⅲ同源建模與分子對接。利用UV/Vis光譜分析了AITC對COXⅡ蛋白活性的影響，試驗結(jié)果顯示原核表達產(chǎn)物COXⅡ具有一定酶活，但活性較弱;結(jié)合IR光譜分析結(jié)果，證實AI

8、TC可能與COXⅡ蛋白在N-端或C-端發(fā)生了結(jié)合，致使波數(shù)發(fā)生了藍移。研究選取與COXⅠ（同源率75％）、COXⅡ（同源率60％）、COXⅢ（同源率59％）同源率較高的蛋白牛心細胞色素C氧化酶(PDBID:1V54)為模板，采用modeller9.17軟件對COXⅠ/Ⅱ/Ⅲ進行三維結(jié)構(gòu)模型構(gòu)建?；贏utodock vina1.1模擬平臺，將AITC與COXⅠ/Ⅱ/Ⅲ進行對接，結(jié)果表明AITC均可與三個亞基發(fā)生結(jié)合，其中AITC中的烯丙

9、基位于COXⅠ氨基酸殘基Phe-20、Ile-73、Ile-389、Ile-390、Phe-393和Phe-468組成的疏水性口袋中，AITC中硫原子與Gly-27形成鍵長為3.3(A)的氫鍵相互作用;AITC中的烯丙基位于COXⅡ氨基酸殘基Ile-34、Pro-69、Ile-72和Leu-73所組成的疏水性口袋中，AITC中硫原子與Leu-31形成鍵長為3.4(A)的氫鍵相互作用;AITC中的烯丙基位于COXⅢ氨基酸殘基Ile-63、

10、Leu-81、Phe-235和Gly-236組成的疏水性口袋中，AITC中硫原子與Arg-223形成鍵長為2.8(A)的氫鍵相互作用。綜合分析蛋白疏水性、氫鍵相互作用、范德華力等因素，AITC與COXⅠ/Ⅱ/Ⅲ親和力分別為-3.4 kcal/mol、-3.0 kcal/mol和-3.2 kcal/mol，故AITC對核心亞基的抑制活性順序:COXⅠ＞COXⅢ＞COXⅡ。這與課題組前期利用RNAi技術(shù)，研究AITC對玉米象的作用結(jié)果相似，

11、均對COXⅠ表現(xiàn)出較強的抑制效果。
　　綜上所述，本論文對玉米象三個核心亞基進行了基因克隆與生物信息學(xué)分析，獲得玉米象COXⅡ/Ⅲ完整的開放閱讀框，在此基礎(chǔ)上，利用大腸桿菌原核表達系統(tǒng)和畢赤酵母表達系統(tǒng)對三個核心亞基進行了載體構(gòu)建和嘗試表達，SDS-PAGE和WB驗證結(jié)果表明，只有COXⅡ以可溶性蛋白形式在原核體系中表達成功。通過優(yōu)化誘導(dǎo)條件，對純化后的COXⅡ蛋白進行了濃度分析和活性測定。最后，通過同源建模和分子對接，構(gòu)建了三個