靈芝基因沉默體系的建立及NADPH氧化酶基因家族功能分析.pdf

1、靈芝（Ganodermalucidum）是著名的大型藥用真菌，具有極高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值，在我國和東南亞國家有著悠久的應(yīng)用歷史。靈芝三萜類化合物是靈芝的主要藥用成分之一，具有抗氧化、抗病毒、降血壓和抗腫瘤等活性。靈芝三萜含量的多少是目前衡量靈芝質(zhì)量高低的重要指標(biāo)。最近靈芝基因組測(cè)序工作已經(jīng)完成，為從分子遺傳學(xué)水平研究靈芝三萜生物合成等靈芝基礎(chǔ)生物學(xué)研究提供數(shù)據(jù)支持，有利于推動(dòng)靈芝成為一種新型模式藥用真菌，增加其科研和商業(yè)價(jià)值。但是，靈

2、芝中缺乏簡(jiǎn)便有效的反向遺傳學(xué)體系，限制了人們對(duì)靈芝功能基因組學(xué)研究的進(jìn)展，影響了其藥用價(jià)值的開發(fā)。因此，本研究將從靈芝基因沉默體系的建立，并應(yīng)用該體系對(duì)NADPH氧化酶基因家族功能研究來探討靈芝三萜調(diào)控機(jī)制。主要分為以下幾個(gè)方面:
　?。ㄒ唬╈`芝沉默體系建立:RNA干擾技術(shù)(RNAi)作為一種常見的反向遺傳學(xué)基因操作技術(shù)被廣泛應(yīng)用在動(dòng)物、植物和微生物功能基因組學(xué)研究領(lǐng)域。在本課題研究中，首先通過基于電擊轉(zhuǎn)化不完全酶解靈芝原生質(zhì)體的

3、方法建立了靈芝中簡(jiǎn)便快捷的轉(zhuǎn)基因技術(shù)，成功的將外源綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)入靈芝中。通過抗生素抗性傳代、標(biāo)記基因PCR檢測(cè)、綠色熒光檢測(cè)等手段確定了該方法能夠進(jìn)行外源基因表達(dá)，為靈芝RNAi技術(shù)的建立提供轉(zhuǎn)基因操作平臺(tái)。進(jìn)一步在靈芝中通過BLAST對(duì)比分析發(fā)現(xiàn)具有Dicer同源蛋白，暗示靈芝可能具有RNAi的機(jī)制，利用靈芝內(nèi)源乳清酸核苷-5'-單磷酸脫羧酶基因（ura3作為反向篩選標(biāo)記，構(gòu)建四種沉默載體（頸環(huán)結(jié)構(gòu)沉默載體，正向沉默載體，反向沉默載

4、體以及正反雙向啟動(dòng)子沉默載體）并基于此轉(zhuǎn)基因方法實(shí)現(xiàn)了對(duì)靈芝內(nèi)源基因的沉默。通過系統(tǒng)的比對(duì)以上四種沉默方法，發(fā)現(xiàn)四種沉默方法都不同程度的下調(diào)了ura3基因的表達(dá)，其中雙向啟動(dòng)子沉默不僅載體構(gòu)建方便并且能夠獲得最高的沉默效率（達(dá)到81.9％）。利用這種雙向啟動(dòng)子沉默載體以及ura3的反向篩選特性，進(jìn)而建立了靈芝的共沉默體系，發(fā)現(xiàn)共沉默基因（ura3和laccase1）轉(zhuǎn)錄水平的下調(diào)是有一定相關(guān)性的，這提高了基因沉默的篩選效率。該反向遺傳體

5、系的建立有助于深入研究靈芝中單基因或多基因的功能，為本課題接下來對(duì)NADPH氧化酶基因家族的功能研究提供技術(shù)支持。
　?。ǘ?duì)NADPH氧化酶功能的分析:NADPH氧化酶(Nox)是一類與活性氧(ROS)合成有關(guān)的酶，最近有研究表明其在植物與動(dòng)物中有多種重要的生物學(xué)作用，但是，在絲狀真菌特別是大型擔(dān)子菌中Nox的具體功能還沒有完全被了解。在本課題研究中，根據(jù)靈芝基因組測(cè)序序列，鑒定出NADPH氧化酶基因的兩種Nox亞型（NoxA

6、和NoxB）和一種Nox調(diào)控基因NoxR。采用正反雙啟動(dòng)子RNA沉默的方法研究Nox家族功能。通過沉默NoxA，NoxB和NoxR基因的表達(dá)，并對(duì)其表型研究，發(fā)現(xiàn)這個(gè)基因家族在ROS的合成，調(diào)控靈芝三萜的生物合成、子實(shí)體發(fā)育以及抗氧化脅迫等方面有重要作用。Nox沉默菌株表現(xiàn)出ROS積累降低，靈芝三萜生物合成下調(diào)，子實(shí)體發(fā)育受阻以及對(duì)H2O2耐受性降低等表型。
　?。ㄈ㎞ox對(duì)鈣信號(hào)的調(diào)控機(jī)制研究:動(dòng)植物中，ROS被報(bào)道能夠與鈣信

7、號(hào)通路進(jìn)行互作，激活鈣通道，增加鈣離子向胞內(nèi)的流入進(jìn)而影響鈣信號(hào)傳遞。其中，鈣離子作為生物體內(nèi)重要的第二信使參與多種生物學(xué)功能，但是此類信號(hào)調(diào)控機(jī)制在真菌中鮮有報(bào)道。為了驗(yàn)證靈芝中Nox產(chǎn)生的ROS能否對(duì)鈣信號(hào)產(chǎn)生影響，本課題檢測(cè)了Nox沉默菌株中胞內(nèi)鈣離子含量，發(fā)現(xiàn)Nox沉默轉(zhuǎn)化子中胞內(nèi)鈣離子水平顯著降低。對(duì)其調(diào)控機(jī)理研究發(fā)現(xiàn)，靈芝中ROS影響胞內(nèi)鈣離子水平是通過激活鈣通道增加鈣流入實(shí)現(xiàn)的，同時(shí)結(jié)合轉(zhuǎn)錄水平分析了靈芝中37個(gè)鈣信號(hào)基因

8、響應(yīng)ROS的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)鈣離子信號(hào)基因在ROS刺激早期被激活表達(dá)，而在刺激后期多數(shù)被下調(diào)表達(dá)。通過對(duì)Nox沉默轉(zhuǎn)化子中鈣信號(hào)基因的轉(zhuǎn)錄進(jìn)一步分析，發(fā)現(xiàn)鈣信號(hào)基因轉(zhuǎn)錄能夠受到Nox沉默影響。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)Nox調(diào)控靈芝三萜生物合成及菌絲分叉是通過鈣信號(hào)實(shí)現(xiàn)的，阻斷鈣信號(hào)將導(dǎo)致ROS的調(diào)控效果消失。
　　綜上所述，本研究突出了在靈芝中NADPH氧化酶在靈芝ROS和鈣信號(hào)交互中的作用，與動(dòng)物植物中一樣，在細(xì)胞的生理過程中Nox產(chǎn)