大豆線粒體細(xì)胞色素氧化酶基因分離及序列分析.pdf

1、隨著水稻、玉米等主要農(nóng)作物雜種優(yōu)勢(shì)利用的成功，大豆已成為少數(shù)幾個(gè)沒有大規(guī)模利用雜種優(yōu)勢(shì)的主要作物之一，其主要原因是沒有適于雜交種生產(chǎn)的不育系。自從1993年吉林省農(nóng)科院孫寰等發(fā)現(xiàn)世界上第一個(gè)大豆細(xì)胞質(zhì)雄性不育系以來(lái)，該領(lǐng)域的研究和應(yīng)用迅速發(fā)展，但是對(duì)其細(xì)胞質(zhì)雄性不育的分子機(jī)理研究尚屬空白。 目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于細(xì)胞質(zhì)雄性不育的機(jī)理研究主要集中在植物線粒體上。植物線粒體基因組中，編碼蛋白質(zhì)的基因有cox、3個(gè)細(xì)胞色素氧化酶復(fù)合物的大亞

2、單位Cox Ⅰ、CoxⅡ和CoxⅢ的基因，F(xiàn)0-FlATPase復(fù)合物的4個(gè)亞單位基因，核糖體蛋白小亞單位rps4、rpsl3、rps14以及編碼NADH-輔酶Q氧化還原酶復(fù)合物的幾個(gè)亞單位基因；另外，還有線粒體蛋白自身合成系統(tǒng)中的3個(gè)rRNA(5S、18S和26S)基因和一些tRNA基因。除上述編碼基因外，線粒體基因組中還含有一些功能未知的開放閱讀框(0RF)，并存在大量的非編碼序列。 線粒體細(xì)胞色素氧化酶亞基Ⅱ(Cox Ⅱ)

3、、亞基Ⅲ(CoxⅢ)是植物呼吸作用中還原氧到水分子的重要酶系統(tǒng)成員。目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在玉米、矮牽牛、水稻、小麥、高粱、油菜等細(xì)胞質(zhì)雄性不育系中CoxⅠ、Cox Ⅱ、CoxⅢ、atp6、atp9、atpA、cob等與線粒體能量代謝的相關(guān)基因在基因編碼區(qū)域、基因組織結(jié)構(gòu)或拷貝數(shù)等方面與正常可育保持系有明顯差異，因此推測(cè)這些基因可能與CMS有關(guān)。 本實(shí)驗(yàn)通過(guò)參考大豆線粒體細(xì)胞色素氧化酶亞基Ⅱ基因和亞基Ⅲ基因序列，設(shè)計(jì)并合成保守基因引物，

4、首次從吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院特有的大豆細(xì)胞質(zhì)不育系和保持系材料的線粒體基因組中擴(kuò)增得到這兩個(gè)基因，并對(duì)基因序列做了初步的分析。主要結(jié)果如下： 1．采用了DNase Ⅰ消化法和蔗糖不連續(xù)密度梯度水平超速離心相結(jié)合的方法提取了高質(zhì)量、高純度的大豆線粒體DNA。 2．建立穩(wěn)定的大豆線粒體基因組DNA PCR擴(kuò)增體系。 3．根據(jù)GenBank中登錄的大豆細(xì)胞質(zhì)氧化酶亞基Ⅱ基因序列，合成保守引物，從吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院特有的大豆細(xì)胞

5、質(zhì)不育系和保持系線粒體基因組中擴(kuò)增得到兩個(gè)細(xì)胞色素氧化酶亞基Ⅱ基因，該基因編碼了一個(gè)由280個(gè)氨基酸組成的蛋白。 4．由于克隆的亞基Ⅱ基因序列高度同源且只在供試材料的保持系中克隆到了這個(gè)基因，這表明該基因可能與大豆細(xì)胞質(zhì)雄性不育有關(guān)系。 5．根據(jù)GenBank中登錄的大豆細(xì)胞質(zhì)氧化酶亞基Ⅲ基因序列，合成保守引物，從吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院特有的大豆細(xì)胞質(zhì)不育系和保持系線粒體基因組中擴(kuò)增得到細(xì)胞色素氧化酶亞基Ⅲ基因，該基因編碼了一