C-IAP2在原發(fā)性肝細胞癌中表達的研究.pdf

1、背景與目的:
　　 肝細胞肝癌（Hepatocellular Carcinoma，HCC）是世界成人最常見的惡性腫瘤之一，全球每年約有650，000患者罹患此病，如今肝癌已成為世界第三大癌癥殺手。盡管有關肝癌的生物學特性以及發(fā)生發(fā)展機制研究較多，診斷技術的顯著進步以及外科治療水平的提高，肝癌患者的預后仍然不太理想，外科手術切除后5年復發(fā)率仍高達65％以上。因此，探索評估HCC復發(fā)、轉移傾向的分子機制，對HCC的病程進展、預后評估

2、有重要意義。近年來，多項研究表明，細胞凋亡抑制蛋白C-IAP2(cellular inhibitor of apoptotic protein-2)作為IAPs( inhibitor of apoptotic proteins)家族重要成員之一，廣泛高表達于多種腫瘤細胞，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉移有密切關系。
　　 本研究采用熒光定量PCR、免疫熒光技術和Western Blot檢測三種不同侵襲潛能的肝癌細胞株中C-IAP2

3、mRNA和蛋白的表達情況，分析肝癌細胞株中C-IAP2mRNA和蛋白的表達同肝癌侵襲潛能的關系，并通過熒光定量PCR、免疫組化等技術檢測原發(fā)性肝癌患者肝癌組織，癌邊緣組織及非癌組織中C-IAP2mRNA和蛋白的表達情況，探討C-IAP2mRNA和蛋白的表達與患者臨床病理特征之間的關系，從組織水平分析C-IAP2的表達與HCC復發(fā)、轉移之間的關系，為HCC的臨床診斷、病程進展和預后評估提供新的線索。
　　 方法:
　　 1

4、、運用熒光定量PCR檢測具有不同侵襲轉移潛能的肝癌細胞株HepG2、SMMC7721、HCCLM3中C-IAP2mRNA的表達;并運用細胞免疫熒光技術和Western Blot檢測上述三種細胞株C-IAP2蛋白的表達情況。分析C-IAP2的表達同肝癌細胞侵襲潛能之間的關系。
　　 2、收集南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院肝膽外科2010年11月～2012年1月接受手術治療的原發(fā)性肝癌患者的組織標本，標本均在離體2小時內取材固定，術后均經病理

5、證實。
　　 3、運用熒光定量PCR檢測72例肝癌患者的癌組織與非癌組織中C-IAP2mRNA的表達，以了解C-IAP2mRNA在肝癌組織與非癌組織的表達差異;并分析肝癌組織中C-IAP2mRNA的表達和臨床病理特征之間的關系。
　　 4、運用免疫組化技術檢測75例肝癌患者的癌組織、癌邊緣組織以及對應的非癌組織中的C-IAP2蛋白的表達，以了解C-IAP2蛋白在癌組織、癌邊緣組織及對應的非癌組織的表達差異，進一步分析癌組

6、織中的C-IAP2蛋白表達與臨床病理特征的關系。
　　 5、統(tǒng)計學處理:應用SPSS13.0統(tǒng)計軟件對數據進行統(tǒng)計學處理， C-IAP2在肝癌組織、癌邊緣組織和非癌組織中蛋白陽性表達率的比較以及不同臨床病理特征情況下C-IAP2在肝癌組織中的陽性表達率的比較均采用Pearson Chi-Square檢驗。肝癌組織中C-IAP2mRNA和蛋白不同表達強度的復發(fā)的比較采用生存分析（Kaplan-Meier曲線，log-rank法）。

7、熒光定量PCR的實驗數據采用2-△△CT進行處理，每個樣本重復實驗進行3次實驗，計算各樣本平均CT(threshold cyclenumber)值和△CT值(△CT＝CT C-IAP2-CTGAPDH)，計算2-△△ct（CT＝CT目的-CT對照），其數值表示目的表達值相對于對照表達值的相對倍數，計量資料以X+SD表示。癌組織與對應非癌組織間C-IAP2 mRNA的表達的比較采用配對t檢驗，C-IAP2mRNA的表達與臨床病理參數之間的

8、比較采用兩獨立樣本t檢驗、方差分析、LSD-t檢驗，三種不同侵襲潛能肝癌細胞株C-IAP2 mRNA和蛋白的比較均采用方差分析和LSD-t檢驗，檢驗水準α＝0.05，采用雙側性檢驗。
　　 結果:
　　 1、熒光定量PCR結果顯示C-IAP2mRNA在三種不同侵襲潛能細胞株中均有表達，侵襲轉移潛能最強的HCCLM3表達最高，SMMC7721次之，無侵襲轉移潛能的HepG2表達最低，HCCLM3的表達量為HepG2的54.

9、95倍，SMMC7721的表達量為HepG2的12.13倍，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　 2、Western Blot檢測三種不同侵襲潛能肝癌細胞株C-IAP2蛋白的表達水平，侵襲轉移潛能最強的HCCLM3表達最高（9.109+0.632），SMMC7721次之（2.689+0.637），無侵襲轉移潛能的HepG2表達最低（0.297+0.556），差異有統(tǒng)計學意義（F＝348.001;P＜0.001）。
　　

10、 3、細胞免疫熒光結果顯示每種細胞株胞漿和胞核內都可見不同程度陽性染色，C-IAP2在高侵襲潛能細胞株HCCLM3的胞漿和胞核均呈強陽性表達，而C-IAP2在HepG2、SMMC7721胞核和胞漿中均呈弱陽性表達，C-IAP2在三種細胞株中的表達情況為:HCCLM3＞ SMMC7721＞HepG2。
　　 4、72例肝癌患者肝癌組織中C-IAP2mRNA的表達量較對應的非癌組織明顯升高，癌組織中的表達量為非癌組織的2.70倍，

11、差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.001)。
　　 5、 C-IAP2mRNA在肝癌組織中的表達與患者術前有無癌栓、有無淋巴結轉移、AFP水平、腫瘤病理分化類型、TNM分期以及預后有關(P＜0.05)，術前有癌栓的C-IAP2mRNA表達量為無癌栓的9.65倍，有淋巴結轉移的為無淋巴結轉移的6.53倍，AFP＞400ug/L的為AFP＜400ug/L的2.79倍，TNM分期中Ⅲ-Ⅳ期的表達量為Ⅰ-Ⅱ期的6.63倍，病理分化類型經方差分析

12、和LSD-t檢驗，發(fā)現中分化和低分化者均較高分化者表達量高，而中、低分化之間無差異，C-IAP2mRNA高表達組的術后復發(fā)率比低表達組術后復發(fā)率高。C-IAP2mRNA在肝癌組織中的表達與患者性別、年齡、乙型肝炎表面抗原、腫瘤大小、腫瘤數目、肝硬化以及包膜完整性無關。
　　 6、免疫組化顯示肝癌組織、癌邊緣組織及對應非癌組織的細胞漿內均有C-IAP2蛋白表達。C-IAP2蛋白在癌邊緣組織、癌組織以及非癌組織的陽性表達率分別為86

13、.7％，69.3％和26.7％(X2＝60.057，P＜0.001)。
　　 7、肝癌組織中C-IAP2蛋白陽性表達率與腫瘤分化程度，TNM分期，AFP水平，淋巴結轉移，癌栓以及預后有關(P＜0.05)，C-IAP2陽性表達率隨著分化程度的降低而升高，TNM分期中Ⅲ-Ⅳ期的陽性表達率較Ⅰ-Ⅱ期高，AFP＞400ug/L的患者較AFP＜400ug/L的患者陽性表達率高，術前有癌栓的患者較無癌栓者陽性表達率高，有淋巴結轉移者較無淋巴

14、結轉移者陽性表達率高，C-IAP2陽性高表達組術后復發(fā)率最高，低表達組次之，陰性表達組最低。而與患者性別、年齡、乙型肝炎表面抗原、腫瘤大小、腫瘤數目、肝硬化、包膜是否完整無關（P＞0.05）。
　　 結論:
　　 1、C-IAP2mRNA和蛋白在三種不同侵襲潛能肝癌細胞株中均有表達，侵襲轉移潛能最強的HCCLM3表達最高，SMMC7721次之，無侵襲轉移潛能的HepG2表達最低，C-IAP2mRNA和蛋白的表達同肝癌細胞

15、的侵襲轉移潛能密切相關。
　　 2、肝癌組織中C-IAP2mRNA的表達量較對應的非癌組織明顯升高，C-IAP2蛋白在癌邊緣組織陽性表達率最高，癌組織次之，非癌組織最低。C-IAP2mRNA和蛋白在肝癌組織中的表達與患者術前有無癌栓、有無淋巴結轉移、腫瘤病理分化類型、甲胎蛋白水平、TNM分期以及預后有關，而與患者其他臨床特征無關，這表明C-IAP2的表達水平可能影響原發(fā)性肝癌的腫瘤生物學特性。
　　 3、三種不同侵襲轉移