EphA7在原發(fā)性肝細胞癌中的表達及其體外抑制研究.pdf

1、原發(fā)性肝細胞癌是世界范圍內(nèi)發(fā)病率最高的惡性腫瘤之一,位居惡性腫瘤相關死亡因為的第三位,其中中國原發(fā)性肝細胞癌患者年死亡人數(shù)>20萬,約占世界的53％。近年來,隨著人們對肝癌的日益關注和重視及相關研究的逐漸深入,肝癌的發(fā)病因為及高危因素已基本明確,其發(fā)生發(fā)展過程中所涉及的病理變化也逐漸清楚,對高?；颊叩暮Y查方法更是得到了不斷完善,但肝癌患者的術后生存時間并未得到明顯提高。造成這種結果的主要因為是肝癌患者的病情比較隱匿,確診時多為晚期,導致

2、只有少數(shù)人可以接受根治性手術切除,多數(shù)肝癌患者只能接受姑息性手術,或依賴于化療、放療和其他如肝動脈栓塞化療、無水酒精注射、射頻消融、微波凝固等療法,但這些方法治療后易發(fā)生肝癌復發(fā)且遠期療效不理想。因此,深入研究肝癌的轉移、復發(fā)的機制并探索有效的治療措施仍是當前腫瘤研究的重點。
　　 目前,關于肝癌新的治療理念是以外科治療為主同時聯(lián)合應用多種方法的綜合治療。研究證實,綜合治療較單一治療在治療效果上優(yōu)勢明顯。在這方面,基因治療可被視

3、為一個潛在的輔助治療措施,迄今為止,已經(jīng)完成的臨床實驗均證實,基因治療的副作用在大多數(shù)情況下處于可以接受的范圍內(nèi)。由于基因治療的作用機制與傳統(tǒng)的治療不同,因此將基因治療方法和傳統(tǒng)治療方案的合理組合可以達到協(xié)同治療效應。此外,改良的傳統(tǒng)的治療方法如TACE和PEI可以將基因治療的載體送入肝癌內(nèi)部,從而增加有效劑量并盡可能減少非靶細胞的副作用。RNA干擾技術是研究功能基因組學最有前途的工具,目前被廣泛的應用在基因研究和基因治療中。如今,人們

4、利用這種技術研究已知或可疑的因素在腫瘤形成中發(fā)揮的作用,來探索腫瘤形成過程中新的調(diào)節(jié)因子,從而為疾病的治療提供新的選擇。
　　 Eph(erythropoiet in producing hepatoma cell line)家族是酪氨酸蛋白激酶受體中的最大亞族,參與了胚胎發(fā)育、細胞生長、組織塑形、神經(jīng)系統(tǒng)信號傳遞等重要的生理過程。EphA7作為該家族的重要一員,定位于染色體6q16.1靠近斷裂點的位置,其基因同源性較高且在人體

5、內(nèi)分布廣泛。EphA7受體及其配體Ephrin結合后可形成雙向信號傳導,參與脊椎動物胚胎的早期發(fā)育和軸突導向等許多重要的生理過程,其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、大腦連接處的形成、神經(jīng)嵴細胞導向以及運動神經(jīng)軸突形成過程中發(fā)揮著關鍵作用。以往對EphA7的研究多集中在生理方面,近幾年來,其在腫瘤中所起的作用也被人們?nèi)找骊P注。如在肺癌、結腸癌、胃癌、前列腺癌、多形性惡性膠質(zhì)瘤等多種人類惡性腫瘤中均發(fā)現(xiàn)EphA7的異常表達。此外,有證據(jù)顯示EphA7在

6、腫瘤血管的形成、腫瘤細胞的增殖、侵襲和轉移過程中發(fā)揮著重要作用。但總的來說,對EphA7在腫瘤中的研究尚處于資料和認識的探索、積累階段。目前,國內(nèi)外有關EphA7在肝癌中的研究報道很少,僅做了初步篩查,未能形成系統(tǒng)性研究,且基于較少數(shù)量的臨床標本,有可能會影響結果的可靠性,仍需進一步的研究加以證實。因此,對EphA7在人類原發(fā)性肝癌中表達的情況進行檢測,并從基因水平探索其對肝癌細胞生物學行為的影響,對于了解EphA7在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作

7、用機制、指導臨床工作具有重要的意義。
　　 本研究對EphA7在人類原發(fā)性肝癌、癌旁肝組織及正常肝組織中的表達情況進行檢測,并分析其與原發(fā)性肝細胞癌臨床病理學因素之間的關系,對兩者的相關性及臨床意義作初步探討。在此基礎上,構建針對EphA7基因的siRNA真核表達載體并轉染肝癌細胞SMMC-7721,觀察RNA干擾抑制EphA7的表達對肝癌細胞SMMC-7721生長、增殖和侵襲等生物學行為的影響。然后將轉染后的肝癌細胞在裸鼠中建

8、立移植瘤模型,驗證EphA7的下調(diào)對肝癌細胞在活體動物體內(nèi)生長等的影響,奠定利用該基因治療肝癌的實驗基礎,為了解EphA7在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用機制、靶向EphA7基因治療肝癌提供理論依據(jù)。本研究分為以下四個部分:
　　 第一部分EphA7基因和蛋白在肝癌中的表達及臨床意義
　　 目的
　　 觀察EphA7基因和蛋白在原發(fā)性肝細胞癌中的表達,分析EphA7的表達與肝癌臨床病理特征的關系并探討其臨床意義。
　

9、　 方法：
　　 收集40例肝癌組織及其相應的癌旁肝組織和10例正常肝臟組織標本。40例肝癌患者中男23例,女17例。年齡41～58歲,平均年齡48.3歲。Ⅰ～Ⅱ級16例,Ⅲ～Ⅳ級的24例。Ⅰ～Ⅱ期26例,Ⅲ期14例。分別采用RT-PCR、實時熒光定量PCR、免疫組織化學和Western blot方法檢測上述標本中EphA7基因和蛋白的表達情況,并分析其于原發(fā)性肝癌臨床病理因素的關系。
　　 結果：
　　 1.

10、40例肝癌組織及相應的癌旁肝組織和10例正常肝臟組織中均有EphA7基因的表達,其表達量分別為20.0711±32.0232、4.5184±9.4738和4.1764±4.7193(P=5.399,P<0.05)。統(tǒng)計分析顯示肝癌組織中Ephh7基因的表達量顯著高于癌旁肝組織(P=0.015)和正常肝組織(P=0.013),而在旁癌肝組織和正常肝組織中EphA7基因的表達差異無統(tǒng)計學意義(P=0.998)。
　　 2.EphA7

11、 mRNA的表達與肝癌患者的年齡、腫瘤大小、臨床分期和甲胎蛋白水平等各項臨床病理指標均無關(P>0.05),而與腫瘤的分化程度、門靜脈癌栓和淋巴結轉移有關(P<0.05)。分化程度低的肝癌患者EphA7 mRNA的表達明顯高于分化程度高者(P=0.030),有門靜脈癌栓的患者EphA7 mRNA表達明顯高于無門靜脈癌栓者(P=0.017),有淋巴結轉移者EphA7 mRNA表達明顯高于無淋巴結轉移者(P=0.013)。
　　 3

12、.EphA7蛋白的陽性表達主要定位于肝細胞和肝癌細胞的胞漿,以及纖維間隔內(nèi)血管壁的內(nèi)皮細胞。其中肝癌細胞中EphA7蛋白的陽性表達較強,染色較深。癌旁肝組織及正常肝臟組織雖也可見到EphA7蛋白的陽性表達,但顏色普遍較淺。Western blot分析發(fā)現(xiàn)Ephh7蛋白在肝癌組織、癌旁肝組織和正常組織中的表達量分別為0.5752±0.2590、0.4019±0.2234和0.3169±0.1594(F=7.826,P<0.05)。肝癌組織

13、組織中EphA7蛋白的表達量顯著高于癌旁肝組織(P=0.001)和正常肝組織(P=0.003),而在癌旁肝組織和正常肝組織中的其表達差異無統(tǒng)計學意義(P=0.309)。
　　 4.肝癌組織中EphA7蛋白的表達與肝癌患者的年齡、腫瘤大小、臨床分期等臨床病理指標均無關(P>0.05),而與腫瘤的分化程度、有門靜脈癌栓、淋巴結轉移和AFP水平有關(P<0.05)。分化程度低的肝癌患者EphA7蛋白的表達明顯高于分化程度高者(P=0.

14、001),有門靜脈癌栓的患者EphA7蛋白的表達明顯高于無門靜脈癌栓者(P=0.008),有淋巴結轉移者EphA7蛋白的表達明顯高于無淋巴結轉移者(P=0.033),AFP水平高者EphA7蛋白的表達顯著高于AFP水平低者(P=0.013)
　　 結論：
　　 EphA7不僅參與了正常肝臟細胞的生長發(fā)育過程,還與肝臟細胞的惡性轉化密切相關。其可能在肝癌的惡性轉化、侵襲和轉移等生物學行為中發(fā)揮重要作用。
　　 第二

15、部分pRNA-SiEphA7千擾表達載體的構建與鑒定
　　 目的
　　 成功構建針對酪氨酸蛋白激酶受體EphA7基因的RNA干擾真核表達載體pRNA-siEphA7。
　　 方法：
　　 根據(jù)Genbank上人類EphA7基因的核苷酸序列及siRNA.的設計原則,選擇3段序列:638-656nt、713-73lnt和1456-1474nt作為干擾片段,所有寡核苷酸末端均加上與質(zhì)粒載體pRNA-U6.1/N

16、eo對應的酶切識別位點及轉錄終止子,人工合成針對EphA7的發(fā)夾樣結構siRNA互補雙鏈寡核苷酸。經(jīng)過退火、質(zhì)粒線性化以及體外重組等過程,構建抑制EphA7基因表達的干擾載體pRNA-siEphA7-1、2和3。將干擾載體轉染入感受態(tài)大腸桿菌DH5α后進行克隆和篩選,PCR鑒定及基因測序驗證干擾載體的準確性。
　　 結果：
　　 1.新合成的正義及反義寡核苷酸,經(jīng)退火處理形成雙鏈互補結構。經(jīng)DNA片段純化及回收后,在1.

17、5％的瓊脂糖凝膠上進行電泳,在UVP凝膠成像分析儀上對照Marker進行驗證,可見100bp附近的清晰條帶,與設計的寡核苷酸大小118bp相吻合。
　　 2.以空載體pRNA-U6.1/Neo為對照,使用插入鑒定引物P1和P2進行PCR擴增篩選鑒定,得到310bp左右的擴增片段的陽性克隆,證明已經(jīng)插入pRNA-U6.1/Neo載體。
　　 3.對3個重組質(zhì)粒進行測序,結果證實插入的寡核苷酸序列正確,進一步證實重組質(zhì)粒成功

18、構建。
　　 結論：
　　 構建了針對EphA7基因表達的干擾載體pRNA-siEphA7-1、2和3,經(jīng)克隆、篩選及鑒定,證實其插入的寡核苷酸序列正確,進一步驗證了其準確性并證實干擾載體pRNA-siEphA7構建成功。
　　 第三部分RNA干擾抑制EphA7基因表達對肝癌細胞株SMMC-7721生物學特性的影響
　　 目的
　　 觀察轉染干擾載體pRNA-siEphA7對肝癌細胞SMMC-77

19、21的增殖活性、細胞周期以及體外侵襲能力等生物學行為的影響,篩選出抑制效果最強的干擾表達載體。
　　 方法：
　　 以轉染空載體和未轉染的肝癌細胞SMMC-7721作為對照,將構建好的3組干擾載體pRNA-siEphA7-1、2和3轉染至肝癌細胞SMMC-7721,通過G418篩選的方法建立穩(wěn)定轉染的肝癌細胞SMMC-7721/siEphA7。利用Real-time PCR和Western blot技術檢測轉染干擾載體前

20、后肝癌細胞SMMC-7721中EphA7基因和蛋白的變化,MTT法測定轉染干擾載體前后肝癌細胞SMMC-7721的增殖活性的改變,流式細胞技術分析轉染干擾載體前后肝癌細胞SMMC-7721細胞周期的變化,Transwell小室侵襲實驗檢測轉染干擾載體前后對肝癌細胞SMMC-7721體外侵襲能力的影響。
　　 結果：
　　 1.通過熒光倒置顯微鏡,可發(fā)現(xiàn)轉染干擾載體pRNA-siEphA7-1、2和3、轉染空載體的肝癌細胞

21、SMMC-7721中均可見清晰的綠色熒光,證明其轉染成功。而未轉染的肝癌細胞SMMC-7721則不見熒光。
　　 2.實時熒光定量PCR結果顯示,轉染干擾載體pRNA-siEphA7-1、2和3、轉染空載體和未轉染的的肝癌細胞SMMC-7721中EphA7基因的相對表達量分別為:0.1911±0.0153、0.1488±0.0199、0.0874±0.0123、0.4293±0.0533、0.4311±0.0410。經(jīng)統(tǒng)計分析顯

22、示三組轉染干擾載體的肝癌細胞中EphA7基因的表達明顯低于空載體轉染組和未轉染組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),在三組轉染干擾載體的肝癌細胞中,轉染pRNA-siEphA7-3的肝癌細胞中EphA7基因的表達最低,與其他兩組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。轉染pRNA-siEphA7-1和2的兩組肝癌細胞中EphA7基因的表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。轉染空載體和未轉染載體的肝癌細胞中EphA7基因的表達差異無統(tǒng)計學意

23、義(P>0.05)
　　 3.Western blot結果顯示轉染干擾載體pRNA-siEphA7-1、2和3、轉染空載體和未轉染的的肝癌細胞SMMC-7721中EphA7蛋白的相對表達量分別為:O.2786±0.0392、O.3011±0.0372、0.2142±0.0147、0.5822±0.0291和0.5832±0.0154。三組轉染干擾載體的肝癌細胞中EphA7蛋白的表達低于空載體轉染組和未轉染組,差異有統(tǒng)計學意義(P

24、<0.05)。其中轉染pRNA-siEphA7-3后對肝癌細胞中EphA7蛋白表達抑制最為明顯,顯著低于另外兩個干擾載體轉染組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。轉染pRNA-siEphA7-1和2的兩組肝癌細胞之間,以及轉染空載體和未轉染的肝癌細胞之間EphA7蛋白的表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)
　　 4.經(jīng)MTT法檢測轉染干擾載體pRNA-siEphA7-1、2和3、轉染空載體及未轉染的肝癌細胞SMMC-7721的體

25、外增殖能力并繪制生長曲線,發(fā)現(xiàn)第1天各組之間細胞增殖速度無明顯差異(P>0.05)。自第2天開始,轉染干擾載體的三組肝癌細胞增殖速度明顯低于空載體轉染組和未轉染組(P<0.05),但轉染干擾載體的三組肝癌細胞之間增殖速度無明顯差異(P>0.05)。自第3天開始,轉染pRNA-siEphA7-3的肝癌細胞增殖速度開始低于轉染干擾載體pRNA-siEphA7-1和2的肝癌細胞,并持續(xù)至第7天(P<0.05)。自第5天開始,轉染干擾載體pRN

26、A-siEphA7-1的肝癌細胞增殖速度開始低于轉染pRNA-siEphA7-2的肝癌細胞,并持續(xù)至第7天(P<0.05)。而空載體轉染組和未轉染組的肝癌細胞之間增殖速度始終沒有統(tǒng)計學差異(P>0.05)。
　　 5.流式細胞檢測結果發(fā)現(xiàn)轉染干擾載體pRNA-siEphA7-1、2和3、轉染空載體和未轉染載體的肝癌細胞SMMC-7721在G1期、G2期和S期的細胞分布比例基本相近,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
　　

27、 6.Transwell小室侵襲實驗結果發(fā)現(xiàn)轉染干擾載體pRNA-siEphA7-1、2和3的肝癌細胞SMMC-7721穿過人工基底膜的細胞分別是23.6±3.65、27±5.57和13.4±3.43。pRNA-siEphA7-3轉染組的肝癌細胞穿膜細胞數(shù)明顯低于pRNA-siEphA7-1和2轉染組的穿膜細胞數(shù),差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。而pRNA-siEphA7-1和2轉染組的肝癌細胞穿膜細胞計數(shù)無統(tǒng)計學差異(P>0.05)

28、。轉染干擾載體的三組肝癌細胞穿膜細胞計數(shù)明顯低于空載體轉染組(68.6±6.50)和未轉染組(72±9.30),差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)?？蛰d體轉染組和未轉染組相比,其穿膜細胞計數(shù)差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
　　 結論：
　　 轉染干擾載體pRNA-siEphA7-1、2和3后,肝癌細胞SMMC-7721中EphA7基因及蛋白的表達明顯受到抑制。EphA7的下調(diào)使肝癌細胞SMMC-7721的增殖活性明顯降

29、低、體外侵襲能力減弱,但細胞周期的變化不大。3組干擾載體中以pRNA-siEphA7-3(1456-1474nt)的干擾效果最好。
　　 第四部分RNA干擾抑制EphA7基因表達對裸鼠肝癌移植瘤生長的影響
　　 目的
　　 通過建立裸鼠肝癌移植瘤模型,在活體動物體內(nèi)觀察siRNA阻斷EphA7基因表達對肝癌細胞SMMC-7721生長的影響。
　　 方法：
　　 裸鼠荷瘤模型采用左上肢皮下注射肝癌細

30、胞的方法建立。將32只裸鼠隨機分為4組,每組8只,根據(jù)皮下注射細胞的不同分為以下幾組:SMMC-7721組(注射肝癌細胞SMMC-7721)；SMMC-7721/siEphA7組(注射轉染干擾載體pRNA-siEphA7-3的肝癌細胞SMMC-7721):SMMC-7721/Vector。組(注射轉染空載體的肝癌細胞SMMC-7721)；PBS組(不注射細胞,僅注入PBS做對照)。移植瘤模型成功建立后5周以頸椎脫臼法處死裸鼠,觀察并比較

31、各組肝癌移植瘤的大小及重量,應用Real-time PCR、免疫組織化學技術以及Western blot檢測荷瘤組織中EphA7基因和蛋白的表達情況。
　　 結果：
　　 1.注射細胞約9～12天后,除PBS組外其余各組均可在注射部位的發(fā)現(xiàn)肝癌移植瘤的形成,證明肝癌細胞SMMC-7721、轉染干擾載體以及空載體的肝癌細胞SMMC-7721在裸鼠體內(nèi)均有成瘤活性,可成功建立裸鼠肝癌移植瘤模型。
　　 2.移植瘤模型

32、建立后第35天,S刪C-7721組、SMMC-7721/siEphA7-3組和SMMC-7721/Vector組的移植瘤體積分別為2.19±1.18cm3、0.84±0.32cm3和2.33±0.97cm。,重量分別為1.78±0.58g、0.79±0.14g和1.83±0.72g。SMMC-7721組和SMMC-7721/Vector組的移植瘤體積和重量明顯大于SMMC-7721/siEphA7-3組的移植瘤體積,差異有統(tǒng)計學意義(P

33、<0.05),而SMMC-7721組和SMMC-7721/Vector組的移植瘤體積大小和重量差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。轉染干擾載體pRNA-siEphA7-3對裸鼠肝癌移植瘤的的抑瘤率為55％。
　　 3.實時熒光定量PCR結果顯示SMMC一7721/siEphA7-3組、SMMC-7721/Vector組和SMMC-7721組的裸鼠移植瘤組織中EphA7基因的表達分別是0.1911±0.0204、0.3900±0.0

34、863和0.4219±0.0595。SMMC-7721/siEphA7-3組中EphA7基因的表達明顯低于SMMC-7721組和SMMC-7721/Vector組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),而SMMC-7721組和SMMC-7721/Vector組之間EphA7基因的表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)
　　 4.免疫組化分析結果顯示SMMC-7721/siEphA7-3組EphA7蛋白陽性染色的細胞較少,染色較淺,呈淺

35、黃色。而SMMC-7721組和SMMC-7721/Vector組的EphA7蛋白陽性染色細胞較多,染色較深,呈棕黃色。Western blot分析顯示,SMMC-7721/siEphA7-3組、SMMC-7721/Vector組和SMMC-7721組的裸鼠移植瘤組織中EphA7蛋白的表達分別是0.2044±0.0153、0.4582±0.0631和0.4816±0.0607,SMMC-7721/siEphA7-3組中EphA7蛋白的表達