兔皮質(zhì)骨來(lái)源成骨細(xì)胞與三種支架材料的體外實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:對(duì)通過(guò)酶消化法獲取的兔尺骨皮質(zhì)骨細(xì)胞進(jìn)行鑒定,探討其體外生長(zhǎng)、增殖能力及理想的作為種子細(xì)胞的代數(shù);檢測(cè)兔皮質(zhì)骨成骨細(xì)胞在自制小牛脫蛋白松質(zhì)骨、凍干松質(zhì)骨(XKC-FDB系列同種骨)及可吸收性明膠海綿三種支架上的生長(zhǎng)情況,對(duì)三種支架材料與兔皮質(zhì)骨成骨細(xì)胞的生物相容性進(jìn)行評(píng)價(jià),并用不同的細(xì)胞密度與三種支架材料復(fù)合培養(yǎng),探求合適的細(xì)胞接種密度。為骨組織工程的細(xì)胞來(lái)源、載體材料的選擇和進(jìn)一步動(dòng)物體內(nèi)試驗(yàn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法與

2、結(jié)果:
　　 第一章兔皮質(zhì)骨來(lái)源成骨細(xì)胞體外培養(yǎng)與鑒定的實(shí)驗(yàn)研究
　　 從3月齡新西蘭大白兔(雌雄不限)獲取尺骨皮質(zhì)骨,通過(guò)酶消化法獲取原代細(xì)胞,適時(shí)傳代。每日倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)及增殖特征:MTT法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖情況,繪制生長(zhǎng)曲線;檢測(cè)第2、3、6、7和8代細(xì)胞ALP:行ALP染色、I型膠原免疫組織化學(xué)染色及骨鈣素免疫組化染色,對(duì)細(xì)胞進(jìn)行鑒定。結(jié)果:分離培養(yǎng)出的原代細(xì)胞,形態(tài)類似成纖維細(xì)胞,具有良好的體外增殖

3、能力,細(xì)胞倍增時(shí)間約為7天,各項(xiàng)染色檢測(cè)呈強(qiáng)陽(yáng)性。細(xì)胞增殖速度:第1～2天,各代細(xì)胞無(wú)差別(P＞0.05),第3天開(kāi)始第7、8代細(xì)胞落后于第2、3和6代細(xì)胞,一直持續(xù)到第10天(P＜0.05),而第2、3代同第6代細(xì)胞及第7代同第8代細(xì)胞之間無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。ALP檢測(cè):第2、3、6代成骨細(xì)胞高于第7、8代細(xì)胞(P＜0.05)。
　　 第二章兔皮質(zhì)骨來(lái)源成骨細(xì)胞與三種支架材料的復(fù)合培養(yǎng)
　　 將成骨細(xì)胞接種到

4、三種支架材料上,進(jìn)行體外復(fù)合培養(yǎng),用倒置相差顯微鏡、掃描電鏡觀察細(xì)胞在支架材料上的生長(zhǎng)、增殖情況,并進(jìn)行MTT、細(xì)胞上架率、ALP及骨鈣素檢測(cè)。結(jié)果:倒置相差顯微鏡顯示三種支架為多孔網(wǎng)狀,孔隙互相通連,隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛,增殖迅速。掃描電鏡顯示復(fù)合培養(yǎng)3d時(shí),有較多的細(xì)胞粘附并鋪展在支架上,培養(yǎng)6d時(shí),細(xì)胞完全伸展,呈長(zhǎng)梭形:10d時(shí)細(xì)胞分泌較多的細(xì)胞外基質(zhì),重疊生長(zhǎng)并連接成網(wǎng)狀,尤以兩種骨性材料組明顯。MTT檢測(cè)顯示三種支

5、架材料在實(shí)驗(yàn)前期不影響成骨細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖(P＞0.05);后期(9d、12d)能促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖及分泌,與對(duì)照組比較有顯著性差異(P＜0.05),而三種支架材料組之間無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。細(xì)胞上架率:當(dāng)細(xì)胞接種密度為1×106/ml時(shí),可吸收明膠海綿細(xì)胞上架率最高,為45.52±3.15％。ALP檢測(cè),細(xì)胞密度為1×105/ml時(shí)各組之間無(wú)顯著性差異(P＞0.05),細(xì)胞密度為1×106/ml時(shí)三種支架材料組高于對(duì)照組(P＜

6、0.05),三種支架材料組之間無(wú)顯著性差異(P＞0.05),細(xì)胞密度為6×106/ml及1×107/ml時(shí),可吸收明膠海綿組＞小牛脫蛋白松質(zhì)骨組＞凍干松質(zhì)骨組＞對(duì)照組(P＜0.05);在12d時(shí)細(xì)胞密度為6×106/ml的各組支架材料ALP＞細(xì)胞密度為1×107/ml的各組支架材料ALP。骨鈣素檢測(cè):第14天小牛脫蛋白松質(zhì)骨組及凍干松質(zhì)骨組明顯高于對(duì)照組及可吸收明膠海綿組(P＜0.05):第21天及第28天,小牛脫蛋白松質(zhì)骨組＞凍干松質(zhì)

7、骨＞可吸收明膠海綿組＞對(duì)照組(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1、兔尺骨皮質(zhì)骨體外可以培養(yǎng)出成骨細(xì)胞,體外培養(yǎng)的成骨細(xì)胞具有增殖、分泌功能,其中第2、3、6代細(xì)胞增殖和分泌功能強(qiáng)于第7、8代細(xì)胞。新西蘭大白兔皮質(zhì)骨成骨細(xì)胞理想的作為種子細(xì)胞的代數(shù)為2-6代細(xì)胞。
　　 2、三種支架材料與兔皮質(zhì)骨成骨細(xì)胞理想細(xì)胞接種密度為1×106/m1～6×106/ml;隨細(xì)胞接種密度上升細(xì)胞上架率在下降,當(dāng)細(xì)胞接種密度為

8、1×106/ml時(shí),可吸收明膠海綿細(xì)胞上架率最高,為45.52±3.15％。
　　 3、在理想接種密度下,ALP檢測(cè),可吸收明膠海綿＞小牛脫蛋白松質(zhì)骨＞凍干松質(zhì)骨＞對(duì)照組;骨鈣素檢測(cè),小牛脫蛋白松質(zhì)骨＞凍干松質(zhì)骨＞可吸收明膠海綿＞對(duì)照組。
　　 4、本實(shí)驗(yàn)制備的小牛脫蛋白松質(zhì)骨與兔皮質(zhì)骨成骨細(xì)胞具有良好的生物相容性及骨誘導(dǎo)性,且制備方便,價(jià)格低廉,是很好的骨替代材料,把小牛脫蛋白松質(zhì)骨與兔皮質(zhì)骨成骨細(xì)胞復(fù)合構(gòu)建組織工程骨