紅移藻膽蛋白和光敏色素的研究及分子進化.pdf

1、光作為能量與信息的攜帶者，不僅可以通過光合作用轉(zhuǎn)化為化學(xué)能，為生物體提供能量，還可以通過感光受體對生物體的生理過程進行調(diào)節(jié)。藍(lán)細(xì)菌作為光合作用的模式生物，主要由藻膽體捕獲光能。為了提高光合效率，藍(lán)細(xì)菌在長期的自然選擇過程中進化出了一套由藍(lán)細(xì)菌光敏色素識別和響應(yīng)，從而調(diào)節(jié)藻膽體重構(gòu)的機制。在藻膽體中，有一種核膜連接蛋白(ApcE)，作為藻膽體的能量傳遞終端，特征吸收峰及熒光峰均比其他藻膽蛋白更為紅移，這種特性使得其進化為近紅外熒光探針具有

2、一定的優(yōu)勢。而藍(lán)細(xì)菌光敏色素(CBCR)可以響應(yīng)光的變化，這使得其適合發(fā)展成為光控開關(guān)探針。
　　在普通的藍(lán)細(xì)菌中，共價連接藻藍(lán)膽素的核膜連接蛋白(ApcE1)最大吸收峰在660 nm，最大熒光峰在675 nm。近期發(fā)現(xiàn)了一類可以利用近紅外光進行光合作用的藍(lán)細(xì)菌，并在這類藍(lán)細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)了吸收峰大于700 nm，熒光峰大于710nm的組分。Synechococcus sp.PCC7335就屬于這類藍(lán)細(xì)菌。通過序列比對，在這個藻中找到了

3、一個沒有保守性半胱氨酸的核膜連接蛋白(ApcE2)，可能與紅移的組分有關(guān)。為了證實其特征吸收峰及特征熒光峰是否發(fā)生紅移，將其N端結(jié)合色素的結(jié)構(gòu)域(1-273)克隆至表達(dá)載體并與產(chǎn)生色素PCB、PEB、PΦB的色素合成酶在大腸桿菌中進行共表達(dá)，產(chǎn)生的色素蛋白的最大吸收峰分別在700 nm、615 nm和711 nm，最大熒光峰分別在714nm、628 nm和726 nm，相比較典型的ApcE1，特征峰均紅移了近40 nm。由于雙體的PCB

4、-ApcE2(1-273)與之后經(jīng)過截短的單體PCB-ApcE2(24-245)最大吸收峰均在700 nm，最大熒光峰均在714nm，因此排除了激子耦合而引起光譜紅移的可能性。經(jīng)過酸性尿素變性實驗、蛋白膠的醋酸鋅染色及氯仿萃取實驗，證明了光譜的紅移主要是由于色素與蛋白的非共價連接，進而保留了色素Δ3，31間的雙鍵，使得共軛雙鍵的長度增長導(dǎo)致的。這種不需要裂合酶的催化、非共價的色素化為近紅外熒光團的開發(fā)提供了新的思路。為了驗證ApcE2作

5、為熒光探針的潛力，將色素合成酶的基因與ApcE2構(gòu)建到一個質(zhì)粒上進行標(biāo)記，在大腸桿菌中得到成功運用。為了進一步將其優(yōu)化成近紅外熒光探針，對ApcE2進行了定點誘變，得到了可以非共價連接膽綠素的誘變體，使最大熒光峰更進一步紅移至730 nm。為了拓展應(yīng)用范圍，嘗試通過體外添加色素與體內(nèi)合成色素兩種方式提供發(fā)色團，在動物細(xì)胞內(nèi)進行表達(dá)，雖然沒有檢測到熒光，但這些工作為下一步優(yōu)化研究奠定了基礎(chǔ)。
　　Chr.thermalis PCC7

6、203也是一種可以利用近紅外光進行光合作用的藻，通過序列比對我們發(fā)現(xiàn)了一個別藻藍(lán)蛋白ApcF2，其與前面研究的ApcE2類似，也沒有保守半胱氨酸。為了檢測其光譜性質(zhì)是否適合作為近紅外熒光探針，在大腸桿菌中共表達(dá)ApcF2和合成色素的酶，產(chǎn)生的色素蛋白PCB-ApcF2最大吸收峰在674 nm，最大熒光峰在700nm，酸性尿素變性實驗證明了色素與蛋白的連接亦是非共價的。為了進一步將其開發(fā)為近紅外熒光探針，對蛋白不保守的N端氨基酸進行了缺失

7、，結(jié)果發(fā)現(xiàn)雙體的ApcF2也可以變?yōu)閱误w，并發(fā)現(xiàn)N端截短的氨基酸在保持蛋白的活性及色素的穩(wěn)定性方面存在重要作用。相比較ApcE2，ApcF2在進化為近紅外熒光探針方面更具優(yōu)勢:ApcF2分子量更小，且蛋白可溶性非常好，在較寬的pH范圍內(nèi)依然保持較高的活性，故運用范圍更廣。在本章實驗中，還對大腸桿菌的膜進行了標(biāo)記，并運用熒光顯微鏡觀察到了熒光，這為下一步在動物細(xì)胞中的標(biāo)記奠定了基礎(chǔ)。在對ApcF2(20-169)進行隨機誘變的實驗中，我們

8、得到了光譜藍(lán)移、熒光量子產(chǎn)率更高的誘變體，這為更進一步進行雙色標(biāo)記提供了原材料。
　　近年來，將光敏色素作為光受體來構(gòu)建光遺傳學(xué)工具的研究越來越多。由于動物組織對可見光的不可透性及紅外線的強烈衰減性，使得對遠(yuǎn)紅及近紅外光響應(yīng)的光受體越來越受重視。本研究中，我們從來源于Synechocystis sp.PCC6803中的藍(lán)細(xì)菌光敏色素1393gaf3出發(fā)進行分子進化，嘗試尋找到對遠(yuǎn)紅及近紅外光響應(yīng)的誘變體。通過對誘變位點及光譜的分析