藻膽蛋白裂合酶性質(zhì)及催化功能研究.pdf

1、藻膽蛋白是存在于藍(lán)藻、紅藻和隱藻中的一類(lèi)同源蛋白家族。藻膽色素生物合成的最后一步為色素與脫輔基藻膽蛋白的連接。體內(nèi)，藻膽色素的正確連接一般都需要特異的裂合酶來(lái)催化完成。目前已知藻紅藍(lán)蛋白裂合酶PecE/F催化藻藍(lán)色素PCB異構(gòu)化形成PVB并與脫輔基蛋白PecA連接；藻藍(lán)蛋白裂合酶CpcE/F催化藻藍(lán)色素PCB與脫輔基蛋白CpcA的連接。PecE/F與CpcE/F之間有20－40﹪的相似性，對(duì)這兩個(gè)酶的催化機(jī)理的研究還是空白。本研究通過(guò)比

2、較兩者的氨基酸序列，構(gòu)建缺失突變體、定點(diǎn)突變體和使用化學(xué)修飾的方法對(duì)其功能區(qū)域及功能氨基酸殘基進(jìn)行分析。首次研究了PecE和PecF催化反應(yīng)中的輔助因子和酶動(dòng)力學(xué)。研究表明：巰基乙醇(5mmol/L)和Mg2+(5mmol/L)、Mn2+(3mmol/L)是催化反應(yīng)所必需的，1﹪TritonX-100可提高反應(yīng)效率。磷酸鉀和Tris混合緩沖液可以提高蛋白的溶解性和減少其對(duì)金屬離子的的結(jié)合，有利于催化反應(yīng)。酶動(dòng)力學(xué)研究表明催化反應(yīng)遵循順序

3、反應(yīng)機(jī)制，在催化反應(yīng)中：PecE主要催化PCB與脫輔基蛋白的連接，PecF主要催化色素PCB異構(gòu)化形成藻紫膽素PVB。PCB與脫輔基蛋白PecA在無(wú)酶催化下形成共價(jià)連接產(chǎn)物：31-Cys-PecA-PCB，但不能作為PecE/F的底物被催化形成正確的產(chǎn)物：31-Cys-PVB-PecA。利用鎳離子鰲合親和層析提純，證明PecE和PecF之間可形成復(fù)合物。在序列分析和實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)研究的PecE/F缺失突變體的基礎(chǔ)上，構(gòu)建了缺失突變體PecE

4、(1-267)和PecF(57-212)，前者酶活性無(wú)變化，PecF(57-212)的研究表明PecF中4個(gè)獨(dú)特的連續(xù)組氨酸殘基對(duì)酶活性沒(méi)有貢獻(xiàn)。PecE和PecF中4個(gè)高同源性的半胱氨酸殘基進(jìn)行了定點(diǎn)突變，研究了突變體PecE(C48Q)、PecE(C91L)、PecE(C161L)和PecF(C122L)在三種不同狀態(tài)（未提純，提純，尿素變性復(fù)性）下的酶活性。酶動(dòng)力學(xué)研究表明：PecE的第48位半胱氨酸殘基與底物結(jié)合有關(guān)，第91位半

5、胱氨酸殘基參與酶催化和底物結(jié)合；PecF第122位半胱氨酸殘基位于酶活性中心，對(duì)它的突變導(dǎo)致了酶活性喪失。PecE和PecF都可以與底物PCB結(jié)合，半胱氨酸殘基的突變導(dǎo)致了PecE突變體結(jié)合PCB能力的下降和PecF(C122L)光譜的紅移。PecE/F與PCB的結(jié)合在紫外光激發(fā)下顯示熒光，在尿素變性條件下吸收光譜范圍在550~660nm之間。透析以后，吸收光譜可以回復(fù)到600nm。PecE和PecF的缺失突變體和相應(yīng)的亞基結(jié)合實(shí)驗(yàn)表明

6、缺失突變體都沒(méi)有失去形成復(fù)合物的能力。使用專(zhuān)一性的化學(xué)修飾劑對(duì)PecE和PecF中功能氨基酸殘基進(jìn)行了研究。1,2-環(huán)己二酮（1,2-cyclohexanedione，簡(jiǎn)稱(chēng)CHD）和苯乙二醛（phenylglyoxal，簡(jiǎn)稱(chēng)PGO）修飾表明兩者各有一個(gè)精氨酸殘基是酶活性必需的。焦碳酸二乙酯(diethylpyrocarbonate，簡(jiǎn)稱(chēng)DEPC)修飾組氨酸殘基和N-溴化琥珀酰亞胺(N-bromosuccinimide，簡(jiǎn)稱(chēng)NBS)修飾色

7、氨酸殘基，使用鄒氏作圖法表明：PecE和PecF各有一個(gè)組氨酸殘基和色氨酸殘基對(duì)酶活性是必需的。DEPC修飾PecF(57-212)，表明PecF的121位組氨酸殘基可能是關(guān)鍵氨基酸殘基。Ε-氨基和羧基不是PecE和PecF酶活性的必需基團(tuán)。通過(guò)比較CpcE/F和PecE/F的氨基酸序列，設(shè)計(jì)CpcE/F的10個(gè)突變體：CpcE(42-276)，CpcE(1-237)，CpcF(21-213)，CpcF(1-160)，CpcF(10-2

8、13)，CpcE(1-274)，CpcE(L276D)，CpcE(1-272)，CpcE(L275D)，CpcF(I9K)。CpcF(21-213)和CpcE(1-237)失去酶催化活性，CpcF(1-160)折疊發(fā)生錯(cuò)誤，在尿素復(fù)性時(shí)恢復(fù)部分酶活性并且可與CpcE結(jié)合。酶動(dòng)力學(xué)研究顯示：CpcE(L275D)和CpcF(I9K)可能與底物結(jié)合有關(guān)。CpcE/F與PecE/F之間的交叉重組研究表明，CpcE和PecF可催化生成相對(duì)活性為

9、6﹪的a-PEC，CpcF和PecE則不能催化此反應(yīng)。對(duì)CpcE和CpcF進(jìn)行化學(xué)修飾證明：CpcE中各有一個(gè)精氨酸殘基和色氨酸殘基是必需基團(tuán)，CpcF中一個(gè)羧基為必需基團(tuán)。CpcE和CpcF的催化可能遵循酸堿催化的機(jī)制，重組體系中不需要使用還原劑。CpcE和CpcF可以與藻藍(lán)色素PCB結(jié)合，結(jié)合有利于減少PCB與脫輔基蛋白自發(fā)連接形成副產(chǎn)物。結(jié)合于CpcE或CpcF或者CpcEF上的PCB可以轉(zhuǎn)移到脫輔基蛋白CpcA上，形成正確的產(chǎn)物