肝炎病毒檢測(cè)條件的優(yōu)化及藻膽蛋白相互作用研究.pdf

1、第一部分:病毒性肝炎是對(duì)人類健康危害嚴(yán)重的傳染病之一。由于HBV和HCV混合感染不僅是原發(fā)性肝癌發(fā)生的原因，也是導(dǎo)致肝組織纖維變，加快向肝硬化發(fā)展的重要因素。所以研究HBV、HCV的病理機(jī)制為臨床早期抗病毒干預(yù)治療，控制肝組織纖維化進(jìn)程，提供了理論依據(jù)，對(duì)肝癌防治具有重要意義。
　　 一般對(duì)HBV和HCV檢測(cè)有免疫學(xué)方法和核酸檢測(cè)法，免疫學(xué)方法主要包括放射性標(biāo)記免疫分析技術(shù)、酶免技術(shù)分析（ELISA）、時(shí)間分辨熒光免疫分析（TR

2、FIA）和化學(xué)發(fā)光免疫分析（CLIA）等；核酸檢測(cè)方法主要有斑點(diǎn)雜交技術(shù)和PCR技術(shù)，其中PCR技術(shù)檢測(cè)存在假陽(yáng)性和假陰性的情況，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)優(yōu)化PCR的檢測(cè)條件達(dá)到快速靈敏檢測(cè)，降低假陽(yáng)性和假陰性的目的。
　　 本實(shí)驗(yàn)用已經(jīng)構(gòu)建好的pGEM-T-HBV（C區(qū)/C基因）和pGEM-T-HCV（核心蛋白）作為PCR檢測(cè)的質(zhì)粒模板，通過(guò)改變Mg2+濃度、退火溫度以及采用不同的酶進(jìn)行PCR檢測(cè)條件的優(yōu)化。其中檢測(cè)HBV病毒時(shí)共設(shè)了1.5

3、μl-4.0μl共6個(gè)Mg2+濃度梯度，設(shè)了58.0~62.0℃共12個(gè)溫度梯度，質(zhì)粒模板稀釋濃度從10-1-10-9共9個(gè)濃度梯度。檢測(cè)HCV病毒時(shí)，共設(shè)了1.5~2.0μl共6個(gè)Mg2+濃度梯度，設(shè)了56.0~60.0℃共12個(gè)溫度梯度，質(zhì)粒模板稀釋濃度從10-1~10-9共9個(gè)濃度梯度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明檢測(cè)HBV病毒時(shí)，4.0μl為最佳Mg2+濃度，59℃為最佳退火溫度，天源公司的Taq DNA聚合酶靈敏性最高，對(duì)質(zhì)粒濃度的要求達(dá)到1

4、0-9。當(dāng)檢測(cè)HCV病毒時(shí)，1.5μl為最佳Mg2+濃度，57℃為最佳退火溫度，Bio-Rad公司的iTaq聚合酶靈敏性最高，對(duì)質(zhì)粒濃度的要求達(dá)到10-6。
　　 第二部分:藻膽體(phycobilisome)是存在于藍(lán)藻和紅藻中的一類捕光蛋白復(fù)合物，它由藻膽蛋白（phycobiliprotein）和連接蛋白組成。藻膽蛋白由藻膽色素（phycobilin）與相應(yīng)的脫輔基蛋白中保守性半胱氨酸的巰基以硫醚鍵共價(jià)結(jié)合而成。藻膽蛋白是一

5、類結(jié)構(gòu)相似的色素蛋白。目前已發(fā)現(xiàn)了一種能催化β-CPC84、β-PEC84、α-APC82和β-APC82位半胱氨酸殘基與PCB連接的裂合酶基因cpeS，其編號(hào)為alr0617。為了研究PCB與層理鞭枝藻藻紅藍(lán)蛋白連接的機(jī)制β亞基（β-PEC）第84位Cys連接機(jī)制，現(xiàn)通過(guò)同源性分析，篩選出四個(gè)同源性較高的基因片段，即alr0617，all5339， all5292，alr0647。現(xiàn)根據(jù)國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)，將編號(hào)為alr0617，all5339

6、，all5292，alr0647基因編碼的蛋白命名為CpeS1，CpeT1，CpeS2，CpeT2, CpeT1能分別與CpeT2、CpeS1、PecE形成比較明顯的復(fù)合物，但是只有CpeT1與CpeT2之間形成大約1：1的復(fù)合物。
　　 本研究成功構(gòu)建質(zhì)粒pBT- CpeS1、pBT- CpeS2、pBT- CpeT2、pBT- 3357、pTRG- CpeS1、pTRG- CpeT1、、pTRG- 3357基因。
　　

7、 將pBT- CpeS1、pBT- CpeS2、、pBT- CpeT2、pBT- 3357和pTRG- CpeT1；pBT- CpeS1、pBT- CpeS2、pBT- CpeT2和pTRG- 3357；pBT- CpeS2、、pBT- CpeT2和pTRG- CpeS1共轉(zhuǎn)化大腸桿菌，利用細(xì)菌雙雜交系統(tǒng)，證明pBT- CpeT2、pBT-CpeS2、pBT-CpeS1和pBT-3357的重組子 與pTRG-CpeT1的重組子有相互作