has-microRNA-212在肝癌中抑制組蛋白去甲基化酶RBP2表達(dá)參與肝癌發(fā)生發(fā)展的機制研究.pdf

1、目的:
　　研究一種組蛋白去甲基化酶的microRNA調(diào)控機制,從而豐富人們對于microRNA分子參與惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展機制的認(rèn)識,為microRNA作為一種潛在的腫瘤治療靶位提供一定的參考。
　　方法:
　　1.在組織水平上,用實時定量PCR方法檢測了20對(肝癌組織和肝正常組織)標(biāo)本中has-microRNA-212的水平,和先前檢測的RBP2在這些組織中的表達(dá)水平進行對比分析,初步確定兩者之間的相關(guān)性。還在這些組

2、織中檢測了已知的RBP2下游的靶分子p27kipl和pl6ink4a mRNA的表達(dá)水平,進一步分析has-microRNA-212,RBP2,p27kipl和p16ink4a這幾個分子之間的相關(guān)性。
　　2.在分子水平上,應(yīng)用has-microRNA-212的高表達(dá)質(zhì)粒和抑制質(zhì)粒處理肝癌細(xì)胞,檢測其對RBP2在mRNA和蛋白水平表達(dá)的影響,以及這些處理對RBP2下游的靶分子細(xì)胞周期依賴性激酶抑制劑(CDKI)p27kipl和p1

3、6ink4a的表達(dá)水平的影響。同時也檢測了has-microRNA-212的高表達(dá)質(zhì)粒和抑制質(zhì)粒處理后,肝癌細(xì)胞的衰老表現(xiàn)和增殖狀況,進一步確定has-microRNA-212通過調(diào)控RBP2所引起的生物學(xué)效應(yīng)。最后通過熒光素酶報告基因分析的方法,檢測了has-mieroRNA-212對于RBP2分子mRNA的3’-UTR的作用。具體方法如下:
　　(1).利用羅氏轉(zhuǎn)染試劑把has-microRNA-212的高表達(dá)質(zhì)粒和抑制質(zhì)粒以

4、及各自的對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)入肝癌細(xì)胞系HepG-2和SMMC-7721中,48小時后收細(xì)胞,用Trizol提取總RNA,再用ABI公司microRNA反轉(zhuǎn)錄專用試劑盒反轉(zhuǎn)錄RNA后用該公司的專用熒光定量PCR試劑盒檢測質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率。同時用實時定量PCR檢測RBP2及其調(diào)控的p27kipl和p16ink4a mRNA的表達(dá)水平。RBP2蛋白水平的變化用Western Blot方法分析。
　　(2).has-microRNA-212的高表達(dá)

5、質(zhì)粒及其對照質(zhì)粒被轉(zhuǎn)入肝癌HepG-2和SMMC-77212胞中48小時后,經(jīng)3%甲醛固定細(xì)胞后,進行衰老相關(guān)的β-半乳糖苷酶染色(SA-β-Gal staining),檢測細(xì)胞衰老情況。
　　(3).has-microRNA-212的高表達(dá)質(zhì)粒及其對照質(zhì)粒被轉(zhuǎn)入肝癌HepG-2和SMMC-7721細(xì)胞中48小時后,進行細(xì)胞計數(shù),從每組取300個細(xì)胞,放入孵箱培養(yǎng)2周后,進行克隆計數(shù),即進行克隆形成實驗檢測細(xì)胞增殖能力的大小。

6、r>　　(4).回復(fù)實驗:先向HepG-2細(xì)胞中轉(zhuǎn)入has-microRNA-212的高表達(dá)質(zhì)粒及其對照質(zhì)粒,24小時后再向細(xì)胞中轉(zhuǎn)入RBP2高表達(dá)質(zhì)粒及其對照質(zhì)粒,48小時后用克隆形成實驗檢測細(xì)胞增殖能力。
　　先向SMMC-7721細(xì)胞中轉(zhuǎn)入has-microRNA-212的抑制質(zhì)粒及其對照質(zhì)粒,24小時后再向細(xì)胞中轉(zhuǎn)入RBP2特異性干擾RNA及其陰性對照序列,48小時后用克隆形成實驗檢測細(xì)胞增殖能力。
　　(5).把h

7、as-microRNA-212的高表達(dá)質(zhì)粒和帶有RBP23’-UTR和預(yù)測結(jié)合位點突變的熒光素酶報告基因分別共轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞系,檢測has-microRNA-212對于RBP23’-UTR是否為直接的結(jié)合而發(fā)揮調(diào)控作用。
　　3.在整體動物水平驗證has-microRNA-212對于RBP2的調(diào)節(jié)作用從而達(dá)到干預(yù)腫瘤發(fā)生和生長的效果。把10只7周齡的裸鼠平均隨機分成兩組,每組5只。其中一組注射轉(zhuǎn)染has-microRNA-212高表

8、達(dá)質(zhì)粒48小時后的HepG-2細(xì)胞,注射量為1×106個細(xì)胞/只。對照組注射轉(zhuǎn)染對照質(zhì)粒48小時后的HepG-2細(xì)胞,注射量和前一組相同。觀察每組裸鼠腫瘤的形成和生長情況。5周后麻醉處死裸鼠后,分離腫瘤組織,一半凍于-80度冰箱以用于RNA水平檢測has-mieroRNA-212和RBP2的表達(dá),另一半浸泡于中性福爾馬林以制作石蠟切片,做免疫組化檢測RBP2的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1.組織水平檢測中,在mRNA水平,RBP

9、2的表達(dá)在肝癌組織中比肝正常組織中顯著升高,且has-microRNA-212的表達(dá)和正常組織相比,其在肝癌組織中明顯表達(dá)下調(diào)。此外,p27kipl和p16ink4a則在肝癌組織中表現(xiàn)出較低的表達(dá)水平。
　　2.肝癌HepG-2和SMMC-7721細(xì)胞中轉(zhuǎn)入has-microRNA-212高表達(dá)質(zhì)粒48小時,RBP2的mRNA和蛋白表達(dá)都顯著下降,同時由于RBP2表達(dá)的降低,其下游的p27kipl和p16ink4a表達(dá)出現(xiàn)升高現(xiàn)象

10、。
　　3.肝癌HepG-2和SMMC-7721細(xì)胞中轉(zhuǎn)入has-microRNA-212的抑制質(zhì)粒48小時,RBP2的mRNA和蛋白表達(dá)都顯著上升,同時由于RBP2表達(dá)的增高,其下游的p27kipl和p16ink4a表達(dá)出現(xiàn)降低現(xiàn)象。
　　4.衰老相關(guān)的β-半乳糖苷酶染色表明,在肝癌細(xì)胞系中轉(zhuǎn)has-microRNA-212高表達(dá)質(zhì)粒48小時后,細(xì)胞出現(xiàn)明顯的衰老現(xiàn)象。
　　5.克隆形成實驗表明,在肝癌細(xì)胞系中轉(zhuǎn)入h

11、as-microRNA-212高表達(dá)質(zhì)粒48小時后,細(xì)胞的克隆形成能力明顯受到抑制。
　　6.回復(fù)實驗表明,在HepG-2中轉(zhuǎn)入RBP2高表達(dá)質(zhì)粒能逆轉(zhuǎn)由于has-microRNA-212高表達(dá)質(zhì)粒所誘導(dǎo)的細(xì)胞克隆形成能力的降低。在SMMC-7721中轉(zhuǎn)入RBP2干擾RNA也能逆轉(zhuǎn)由于has-microRNA-212的抑制質(zhì)粒的所誘導(dǎo)的克隆形成能力的增強。
　　7.has-microRNA-212高表達(dá)質(zhì)粒和帶有RBP23’

12、-UTR的熒光素酶報告基因的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染對比于其對照質(zhì)粒的共轉(zhuǎn)染,熒光素酶活性顯著降低。而has-microRNA-212高表達(dá)質(zhì)粒和帶有預(yù)測結(jié)合位點突變的RBP23’-UTR的熒光素酶報告基因共轉(zhuǎn)染,相比于has-microRNA-212高表達(dá)質(zhì)粒和帶有正常的RBP23’-UTR的熒光素酶報告基因共轉(zhuǎn)染,熒光素酶活性則有很大程度上升,即熒光素酶活性得到回復(fù)。
　　8.注射有轉(zhuǎn)入has-microRNA-212高表達(dá)質(zhì)粒的HepG.

13、2細(xì)胞的裸鼠相對于注射轉(zhuǎn)入對照質(zhì)粒細(xì)胞的裸鼠,它們的腫瘤發(fā)生率明顯降低,腫瘤體積的大小也明顯下降,腫瘤系數(shù)(腫瘤重量/裸鼠體重)也明顯下降。實時定量的結(jié)果顯示has-microRNA-212高表達(dá)組裸鼠腫瘤組織中的RBP2明顯降低。免疫組化顯示has-microRNA-212高表達(dá)組裸鼠腫瘤組織中的RBP2蛋白表達(dá)也明顯降低,而其下游的p21CIP2 and p27kipl表達(dá)卻有上升的現(xiàn)象。而且連續(xù)切片免疫組化顯示,腫瘤組織中RBP2